PRiME HLB 前处理技术联合超高效液相色谱-三重四极杆质谱系统检测水产品中17 种磺胺类药物残留

◎ 余海芬，徐 桦，吴真善，包 蔚，朱晓芸，何 锴，黄 忠，战 涛

（上海市嘉定区农业技术推广服务中心，上海 201800）

我国是水产养殖大国，2000 年以来，我国水产品总产量和人均占有量已超世界平均水平，是世界上唯一养殖水产品总量超过捕捞总量的主要渔业国家，并在2002 年成为世界第一大水产品出口国[1]。在水产养殖业中，抗生素主要用来预防和治疗疾病，促进生长和提高饲料报酬率。磺胺类药物是一类人工合成抗生素，在畜牧水产养殖业中被广泛使用，但其在动物性食品中的残留问题一直备受关注。磺胺类药物可通过食物链进入人体，引起过敏反应、皮疹、恶心和呕吐等，在人体内长时间蓄积还可能对生殖系统、神经系统、免疫系统产生潜在的毒性影响[2]。2020 年4 月1 日开始实施的《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》（GB 31650—2019）中对磺胺类药物在食品动物中的残留限量进行了规定，其在水产品中的最高残留限量为100 μg·kg-1[3]。目前，检测水产品中磺胺类药物残留的国家标准方法有酶联免疫吸附法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法[4-7]。其中酶联免疫吸附法易产生假阳性；高效液相色谱法灵敏度低、抗干扰性差，不适合多残留检测分析，因此普遍使用液相色谱-串联质谱法测定水产品中磺胺类药物。PRiME HLB通过型固相萃取柱无须活化平衡，可直接上样，操作简单，且对脂肪、磷脂等物质具有特异性吸附能力。而水产品样品通常含有较多脂肪、磷脂，使用PRiME HLB 小柱可以很好地从水产样品提取物中高效去除脂肪和磷脂，以此降低基质效应，同时不影响回收率。

本文采用PRiME HLB 前处理技术，联合超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱系统建立了水产品中17 种磺胺类药物简单快速的筛选分析方法，以期为水产品中磺胺类抗生素的快速筛查提供新途径。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

SCIEX ExionLC ™系统和SCIEX 6500 三重四极杆质谱系统（美国SCIEX 公司）；Milli-Q 超纯水仪（美国Merck 公司）；固相萃取装置（美国Supelco 公司）；M64 氮吹仪（北京Labtech 有限公司）；Oasis PRiME HLB 固相萃取柱（200 mg/6 mL），美国Waters 公司；C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm），美国Waters公司。

1.2 试剂

甲醇、乙腈，色谱纯，CNW 公司；甲酸，色谱纯，MACKLIN 公司。

1.3 标准物质

磺胺脒、磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺甲噁唑、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺异恶唑、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺索嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺地索辛、磺胺多辛和氘代磺胺邻二甲氧嘧啶-D3，上海安谱实验科技有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 标准溶液配制

将17 种磺胺类药物标准物质用甲醇溶解并定容至20 mL 容量瓶，配制成浓度为1 μg·mL-1的混合标准工作液。将氘代磺胺邻二甲氧嘧啶-D3 内标物用甲醇溶解并定容至20 mL 容量瓶，配制成1 μg·mL-1同位素内标工作液，于4 ℃下避光保存。

分别吸取适量1 μg·mL-1的磺胺混合标准工作液，用初始流动相进行稀释，配制成浓度为1 ng·mL-1、2 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1的校正曲线工作液，其中氘代磺胺邻二甲氧嘧啶-D3 浓度为5 ng·mL-1。

1.4.2 仪器条件

（1） 色谱条件。 色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；进样量：5 μL；流速：0.4 mL·min-1；柱温：30 ℃；流动相为甲酸水溶液（0.1% 甲酸）和甲醇溶液（含0.1%甲酸）；梯度洗脱：0 ～0.5 min，5%B；0.50 ～1.75 min，5%B →10%B；1.75 ～6.50 min，10%B →45%B；6.50 ～8.50 min，45%B →70%B；8.50 ～9.00 min，70%B；9.10 ～11.00 min，5%B。

（2）质谱条件。离子源：ESI 源，正离子模式；IS 电压：5 500 V；气帘气：35 psi；雾化器：55 psi；辅助雾化器：55 psi；源温度：550 ℃；碰撞气：7 psi。

1.4.3 样品前处理

鱼类样品去头、骨、内脏，取肌肉、鱼皮等可食用部分绞碎混合均匀备用，虾类样品去虾头、虾皮、肠腺后绞碎混合均匀备用。准确称取2.50 g（精确至0.01 g）组织匀浆样品于50 mL 离心管中，加入1 μg·mL-1内标工作液25 μL，向离心管中加入10 mL 80%乙腈水溶液（含0.2%甲酸），漩涡混匀，超声10 min。4 ℃条件下12 000 r·min-1离心5 min。取3 mL 上清液通过Oasis PRiME HLB 小柱并收集滤液，准确移取2 mL 滤液至离心管中，40 ℃氮吹至近干。用1 mL 初始流动相定容，超声溶解2 min，过0.22 μm 有机滤膜，供超高液相色谱-三重四极杆质谱仪检测分析。

2 结果与分析

2.1 线性范围及检出限、定量限

本方法采用内标法定量，将17 种磺胺类药物的混合标准工作液配制成1.0 ～50.0 ng·mL-1浓度不等的校正曲线工作液，其中同位素内标物浓度为5.0 ng·mL-1，微孔滤膜过滤后，采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪测定，以特征离子峰面积为纵坐标，以磺胺类药物浓度比为横坐标，绘制标准曲线。结果表明，17 种磺胺类药物的线性范围在1.0 ～50.0 ng·mL-1，相关系数（R2）大于0.99，线性方程见表1。以3 倍信噪比（S/N=3）和10 倍信噪比（S/N=10）确定方法检出限为2 μg·kg-1，定量限为6.3 μg·kg-1。

表1 17 种磺胺类药物的线性方程表

2.2 回收率与精密度

分别考察虾肉和鱼肉2 种基质的加标回收率和精密度。称取2.50 g 空白样品，加入25 μL 1 μg·mL-1混合标准工作液及25 μL 1 μg·mL-1内标工作液，待样品充分混匀后，按照前处理步骤进行操作，用净化后的提取液上机测定，每种样品平行测定6 次，计算方法的回收率和相对标准偏差。从表2 可以看出，17 种磺胺药物的平均回收率在71.3%～118.4%，相对标准偏差在1.2%～13.6%。

表2 17 种磺胺类药物的添加回收率及相对标准偏差表（n=6）

2.3 实际样品分析

采用本方法检测了上海市北部地区主要河道内52 份水产品样品，分别为青虾、克氏原螯虾、鳊鱼、青鱼、翘嘴红鲌等。结果显示，1 份鳊鱼样品检出磺胺对甲氧嘧啶（24.4 μg·kg-1），1 份青鱼样品检出磺胺二甲基嘧啶（9.7 μg·kg-1）。采用农业部1077 号公告—1—2008 方法再次对样品进行验证分析，发现本方法检测结果与标准方法检测结果具有较好的一致性。阳性样品检测结果见表3。

表3 阳性样品检测结果比较表 单位：μg·kg-1

3 结论

本文采用PRiME HLB 小柱对样品进行净化，同位素内标法定量，利用超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪测定了水产品中17 种磺胺类化合物的含量。实验结果表明，PRiME HLB 小柱能够有效去除提取液中的脂肪和磷脂，同时操作简便。该方法重复性和准确性良好，适用于水产品中磺胺类药物的残留检测。