以肺泡灌洗液行结核/非结核分枝杆菌检测对菌阴肺结核的诊断价值

王世艳 赵睿桢 张建勇 赵建军

(遵义医科大学附属医院呼吸与危重症医学科,贵州 遵义 563000)

结核病是由结核分枝杆菌(MTB)引起的一种慢性传染病〔1〕。在2020年,有987万新诊断的结核病患者,受到新型冠状病毒(COVID-19)大流行影响,全球新诊断及报告的结核病患者数量有所下降〔2〕,且该年度在人类免疫缺陷病毒(HIV)阴性人群中有130万人死于该病〔3〕,是单一病原体感染疾病造成死亡的主要原因。结核病以肺结核最常见,主要经呼吸道传播。中国是全球结核病卫生经济的高负担国家之一,结核患者数量居于世界第二位〔4〕。近些年来,由于获得性免疫缺陷综合征和糖尿病发病率的增高,多种耐药肺结核患者的增多,导致全球结核病形势严峻〔5,6〕,且随着结核病患者逐年增多,非结核分枝杆菌(NTM)肺病病例报道亦逐步增加。目前,现常用的痰涂片抗酸染色阳性率低,其中约70%为菌阴肺结核(3次痰涂片均阴性且痰培养阴性)且无法鉴别结核杆菌、非结核杆菌及奴卡氏菌等;利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术(GeneXpert MTB/RIF)检测、MTB环介导等温扩增技术(TB-LAMP)敏感性较高但也无法鉴别结核杆菌、非结核杆菌及奴卡菌等;罗氏培养法是金指标,但存在耗时长,灵敏度低等缺点,故肺结核的诊断困难,漏诊、误诊等情况容易在临床上出现,更使得结核病的控制成为难题,造成很大的卫生经济负担〔7～10〕。因此,如何提高菌阴肺结核患者的阳性诊断率,减少NTM误诊,是临床亟待解决的问题。近年来,MTB/NTM检测在结核病的诊断方面取得了良好效果,使得MTB/NTM检测成为目前结核分子生物学检测的检测方法之一,在临床上得到广泛应用。本研究取菌阴肺结核患者肺泡灌洗液(BALF)作为标本,分别进行GeneXpert MTB/RIF、MTB/NTM及TB-LAMP检测,评估MTB/NTM检测的诊断价值。

1 对象与方法

1.1研究对象 收集遵义医科大学附属医院2017年12月至2021年11月临床诊断为菌阴肺结核(3次痰涂片阴性、1次痰结核菌培养阴性)的患者324例,其中男181例,女143例,平均年龄(54.22±18.33)岁。菌阴肺结核的诊断参照《中国结核病防治规划实施工作指南(2008版)》〔11〕涂阴肺结核的诊断标准及我国卫生行业标准《肺结核诊断》WS288-2017〔12〕。纳入标准:(1)年龄14～96岁;(2)患者3次痰找抗酸杆菌(即时痰、夜间痰、晨痰)均为阴性且1次痰培养阴性。排除标准:(1)患者痰抗酸杆菌涂片阳性;(2)有心肺功能严重下降、血小板、凝血功能障碍,难以耐受支气管镜检查及支气管镜手术有禁忌证;(3)不愿接受支气管镜检查患者。对纳入患者进行支气管镜检查并收集BALF。57例纳入MTB/NTM组,其中男34例,女23例,平均年龄(52.02±17.81)岁。161例纳入GeneXpert MTB/RIF组,男90例,女71例,平均年龄(54.61±19.03)岁。106例纳入TB-LAMP组,男57例,女49例,平均年龄(54.81±17.57)岁。3组年龄、性别差异无统计学意义(P>0.05)。对所有患者进行涂片抗酸染色和罗氏培养。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2仪器与试剂 MTB/NTM核酸检测试剂及仪器由中国北京博奥生物提供,GeneXpert MTB/RIF试剂盒、样品试剂由美国Cepheid公司提供,TB-LAMP检测试剂盒、恒温扩增仪由荣研生物科技有限公司提供,抗酸染色试剂由中国珠海贝索生物技术有限公司提供,罗氏培养基按《结核病实验室检验规程》〔13〕进行制备。

1.3涂片抗酸染色 取BALF于玻片正面涂片,自然干燥后滴加苯酚复红染液染色5 min后以流水自玻片一端缓慢冲洗染液,待沥干后滴加脱色液,脱色1～2 min至无可视染色,最后滴加亚甲蓝溶液染色30～60 s,流水缓慢冲洗,沥干后镜检。

1.4罗氏培养 将BALF标本加入4%NaOH溶液(两者等体积),充分混匀后静置10 min,吸取沉淀液1 ml均匀接种到罗氏培养基斜面上,37 ℃培养箱孵育,观察培养结果。若8 w后未见MTB生长即认定结果为阴性;若酸性罗氏斜面培养基上见菌落生长,则需进一步行抗酸染色检测,检测结果为阳性时,再采用对硝基苯甲酸鉴定菌落为NTM还是MTB,并且进一步行菌群鉴定。

1.5MTB/NTM检测 取BALF样本提取核酸、聚合酶链反应(PCR)扩增、结果判定。对于MTB,其标本扩增曲线呈S形,且Ct值<36,判定其结果为阳性;对于NTM,其标本扩增曲线呈S形,且Ct值<40,判其结果定为阳性。在MTB、NTM均为阳性时,判定为MTB阳性,MTB、NTM均为阴性时,则表示无MTB检出。

1.6GeneXpert MTB/RIF检测 取BALF样本离心15 min(3 000 r/min),取其沉淀液,按GeneXpert MTB/RIF操作说明进行GeneXpert MTB/RIF检测,2 h后直接在检测系统观察结果。GeneXpert MTB/RIF同时检测MTB对利福平的耐药性。由A、B、C、D、E,5条分子探针针对MTB rpoB基因81 bp的利福平耐药核心区间(RRDR)序列,可检测rpoB基因是否突变,判断对RIF耐药性。

1.7TB-LAMP检测 取BALF样本离心15 min(3 000 r/min),取其沉淀液,按照LAMP试剂盒操作说明进行TB-LAMP检测,40 min后由检测仪器判定结果。

1.8统计学分析 采用SPSS17.0软件进行McNemar检验、χ2检验。

2 结 果

MTB/NTM检测阳性率〔43.86%(25/57)〕与罗氏培养〔14.04%(8/57)〕、涂片抗酸染色阳性率〔1.75%(1/57)〕比较,差异均有统计学意义(P<0.001)。GeneXpert MTB/RIF检测阳性率〔54.66%(88/161)〕与罗氏培养〔16.77%(27/161)〕、涂片抗酸染色〔3.73%(6/161)〕阳性率比较,差异均有统计学意义(P<0.001)。TB-LAMP检测阳性率〔49.06%(52/106)〕与罗氏培养〔18.87%(20/106)〕、涂片抗酸染色〔4.72%(5/106)〕阳性率比较,差异均有统计学意义(P<0.001)。3种方法阳性率比较,差异无统计学意义(χ2=2.185,P=0.335)。

3 讨 论

我国每年新发的结核病例约有90万例〔14〕。MTB是引起结核病的主要病菌,是单一病原体感染疾病造成死亡的主要原因,所以对其进行快速检测及鉴别诊断是防控结核疫情传播和扩散的关键。为了尽快发现和诊断肺结核,提高阳性诊断率,对MTB检测方法的积极探索越来越多〔15～18〕。临床上,痰液作为诊断肺部疾病的首选样本,常被用于结核病的诊断〔19〕,但对肺结核儿童,尤其是年龄<5岁的儿童,存在标本采集困难〔20〕,少痰患者亦然。应用痰作为标本进行涂片抗酸染色阳性率低〔21〕,罗氏培养时效低,容易造成延误及漏诊〔22〕,同时部分患者为NTM感染,临床症状、影像学及抗酸杆菌涂片无法鉴别,可能导致误诊,延误病情及增加经济负担。故找到一种能够提高检测阳性率且能够区分MTB与NTM的检测方法成为结核病诊疗临床策略急需解决的问题之一。一方面,临床上通过对菌阴肺结核采取支气管BALF样本离心检测提高阳性率;另一方面,对BALF样本通过MTB/NTM检测方法进行检测提高检测阳性率且能够区分MTB与NTM,该方法采用 PCR-荧光探针法进行核酸检测,采用 DNA 微阵列芯片法对 NTM 阳性的样本进行菌种鉴定,具有简便、快捷的特点。世界卫生组织(WHO)推荐的其他针对结核菌核酸检测方法GeneXpert MTB/RIF,能够快速检测MTB,判断是否对RIF耐药。LAMP是日本学者Notom开发的一种适用于基因诊断的恒温核酸扩增技术,该技术的核心是针对靶基因6个特定区域(F3c、F2c、F1c、B1、B2、B3)设计4个特异性引物(两个外部引物F3、B3,两个内部引物FIP、BIP),利用链置换型DNA聚合酶在等温条件下进行基因扩增〔23〕。本研究结果显示,MTB/NTM检测具有较好诊断效能,对检测人员专业技术要求相对较低,较为简单、快捷,并能鉴别NTM,及时减少NTM患者使用结核药物引起的身体损害及经济损失。GeneXpert MTB/RIF、TB-LAMP检出阳性率亦较高,但其费用偏高,加重了卫生经济负担。本研究中仅采用BALF作为标本对各种检测方法进行比较,结合目前临床需要,可进一步探讨多种样本如胸水、尿液等在各检查方法中的阳性率,向临床提供更加完整、优化的诊断策略。