不同核黄素浓度与可见光光照强度对血浆中大肠杆菌的影响*

刘鸿 莫琴 马荣钠 贾尧 伍晓菲 王迅

上海市血液中心，上海 200051

血液和血液成分的输血传播细菌感染（transfusion-transmitted bacterial infection，TTBI）和脓毒性输血反应（septic transfusion reactions，STRs）是感染性输血疾病的主要原因[1]。虽然血浆由于其冻存的环境并不利于细菌生长，因此被认为存在细菌污染的风险较小，然而血浆在制备和处理的过程中仍可能被细菌污染，如有研究发现在水浴箱中冻融后的血浆被检出受到铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）的污染[2-3]，此外，FDA也曾在2016年报告过一起治疗性血浆置换（单采血浆）被凝固酶阴性葡萄球菌（coagulase-negative staphylococci）污染导致受血者死亡的案例，因此受细菌污染的血浆仍可能成为受血者感染的载体[4]。

目前应对血液和血液成分细菌污染风险的措施包括但不限于手臂消毒、初血分离、细菌培养、快速检测、病原体灭活技术的应用等[1]。其中，病原体灭活技术（pathogen reduction technology，PRT）如核黄素光化学病原体灭活系统经验证可灭活包括血浆和血小板中的多种输血传播病毒、致病菌和寄生虫[5，6]；采用病原体灭活技术不仅可以弥补血站现有检测方法的缺陷，如潜在假阴性，检测灵敏度低等问题，其也为应对一系列已知和未知的新发病原体提供了一种积极主动的预防策略[7]，这对提高血液安全和维持安全可靠的血液供应都有着重要的意义。然而，我国目前尚无自主知识产权的针对血液成分细菌污染的病原体灭活技术，而国外商品化的病原体灭活系统成本高昂。因此，开发具有自主知识产权的血液成分病原体灭活系统就显得尤为重要。而本研究尝试以420 nm可见光为光源，以血液中常见的污染细菌大肠杆菌作为指示菌，血浆作为介质载体，对不同核黄素浓度与可见光光照强度对血浆中大肠杆菌的影响进行探讨，以明确两者与处理效果间存在的量效关系，从而为未来建立更完善的实验条件和有效性的评估提供更多数据支撑。

材料与方法

1 标本来源

随机抽取分装的谷氨酸氨基转移酶（ALT）检测不合格的新鲜冰冻血浆作为实验样本，本研究涉及的所有样本均来自本血站的无偿献血者。本研究获本中心伦理审批（编号：SBC-IRB-2022-24）。

2 试剂与仪器

核黄素（美国Sigma-Aldrich公司，批号：60K0021）；大肠杆菌（ATCC 25922）（Culti-Loops，美国Thermo Scientific公司，批号：348289，美国KwikStik公司，批号：335-557-21）；LB肉汤培养基（上海生工生物公司，批号：I113KA3288）；琼脂粉（上海生工生物公司，批号：I701BA0001）； 一次性大肠杆菌培养皿（上海生工生物公司，批号：I505LA2421）；Costar 12孔细胞培养板（美国Corning公司，批号：26421043）；一次性PVC血袋（上海输血技术公司，批号：181229）；塑料透光扩散板（京棣工品公司）；0.22 μm无菌滤器（冰岛Millipore公司，批号：R0NB16650）；15 mL无菌离心管（美国Corning公司，批号：26421043）；10 mL无菌注射器（上海康德莱公司，批号：K20210103）；一次性涂布棒（美国Biologix公司，批号：MO002890B1203）；420 nm病原体灭活箱改装自上海输血技术公司，含商业性420 nm LED灯珠）；紫外辐照仪计（北京师范大学光电仪器厂）；孵育箱（日本松下公司）；生物安全柜（苏州赛默飞世尔公司）；离心机（德国Eppendorf公司）。

3 方法

3.1 透光率测量

使用420 nm辐照仪检测病原体灭活箱中LED灯珠的辐照强度，随后将测试材料置于LED灯珠中央，使用420 nm 辐照仪贴于测试材料正对LED灯珠的位置检测透光后的辐照强度，每个材料检测各3次，通过计算材料透光后的平均辐照强度与LED灯珠自身的平均辐照强度百分比比值得出透光率。

3.2 核黄素储存液制备

精确称量9.41 mg核黄素溶于25 mL0.9%生理盐水中，并用无菌滤器过滤，配制成1M的核黄素储存液，储存瓶使用锡箔纸包裹，置于4℃冰箱保存。

3.3 大肠杆菌培养

将大肠杆菌（ATCC 25922）原菌接种于LB固体培养基，置于培养箱37℃培养24 h，培养后挑取完整的单菌落接种于液体LB培养基中37℃振荡过夜培养。培养结束后离心菌液并用生理盐水重悬，取少量菌悬液培养以确定原始菌液浓度不低于107CFU/mL。

3.4 实验分组与光照处理

按照处理方式将实验分为三大类：第一类为只添加菌液但不做任何处理的对照组，第二类为只添加菌液并接受光照处理的光照组，第三类为添加菌液与核黄素并接受光照处理的实验组。其中实验组根据核黄素浓度又可细分为4个小组，即50、100、150和300 µM的核黄素浓度组，加上对照组和光照组共6组，每组样本数为1人份。光照处理前，从光照组和各核黄素浓度组的血浆混悬液中取1 mL样本加入12孔板并置于病原体灭活箱中分别接受420 nm可见光的光照处理，每轮光照的光照强度分别为50 mW/cm2、75 mW/cm2和100 mW/cm2，光照时间为55分钟（分别在25、35、45和55分钟取样检测）。

3.5 处理后大肠杆菌的检测

从各组样品中取0.1 mL加入0.9%生理盐水进行梯度稀释，稀释至10-6，每个梯度取100 µL稀释菌液涂布在LB平板上，并置于37℃孵育箱培养过夜后菌落计数。所有实验均重复5次（n=6）。

3.6 评估光照强度对大肠杆菌处理效果的影响

根据在各核黄素浓度下，不同光照强度对大肠杆菌在各时间段中的下降情况建立时间-效果曲线，评估光照强度与大肠杆菌处理效果的相关性。

3.7 评估核黄素浓度对大肠杆菌处理效果的影响

根据在各光照强度下，不同核黄素浓度对大肠杆菌各时间段中的下降情况建立时间-效果曲线，评估核黄素浓度与大肠杆菌处理效果的相关性。

4 统计学分析

采用GraphPad Prism 7软件统计结果，数据以菌落数的平均值±标准差表示。实验组与光照组中各核黄素浓度与光照强度对细菌处理效果是否存在显著差异采用单因素方差分析，各因素与处理效果间的关系用Pearsons相关分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 420 nm可见光的基本参数和对不同材料的透光情况

病原体灭活设备的光源经过专业设计和光谱检测，经验证，该光源在420 nm处有一个明显的吸收峰，因此符合实验的要求[8]。实验前对420 nm可见光对不同材料的透光情况进行评估后发现（表1），培养皿和12孔板对420 nm可见光的透过率超过95%，因此以12孔板作为血浆光照处理的储存容器，血浆在12孔板中的液层厚度保持在约5 mm，照射期间匀速振荡，确保获得均匀光照。

表1 420 nm可见光透光率情况

2 不同光照强度下各核黄素浓度对血浆中大肠杆菌的处理效果

血浆中的大肠杆菌在接受不同强度光照处理55 min后，各核黄素浓度下血浆中的大肠杆菌浓度均出现了不同程度的下降，下降梯度分别为1.7～3.5 log（50 mW/cm2），2.8～≥4.4 log（75 mW/cm2），4.0～≥4.7 log（100 mW/cm2），其中300 µM的核黄素浓度在各光照强度下都显示出至少＞3 log的处理效果（图1）。总体来看，不同光照强度之间对大肠杆菌的处理效果存在显著性差异（F=16.39，P＜0.000 1），其中在50，100和150 µM核黄素浓度下，高强度的光照（100 mW/cm2）对大肠杆菌的处理效果要显著高于低强度的光照（50 mW/cm2）（P＜0.05）。而不同的核黄素浓度组之间对大肠杆菌处理效果也存在显著性差异（F=4.06，P=0.004 9），其中，在低强度光照下（50 mW/cm2），300 µM核黄素浓度对大肠杆菌的处理效果要显著高于50 µM核黄素浓度（P＜0.05）（图1）。

图1 血浆中各核黄素浓度的大肠杆菌在接受不同光照强度光照处理55 min后的下降情况比较（n=6）

3 不同光照强度随时间变化对大肠杆菌的影响

通过对上述实验结果进行分析后发现，各组中接受光照处理的大肠杆菌下降梯度都随着光照时间的增加而升高，而在各核黄素浓度处理下，不同的光照强度对大肠杆菌的影响也各不相同。高强度的光照（100 mW/cm2）与低强度光照（50 mW/cm2）相比，大肠杆菌的梯度下降更快，两者在150 µM核黄素浓度处理光照35 min时对大肠杆菌的处理效果最大差异可达2.72 log（图2）。

图2 各核黄素浓度下不同光照强度在各时间段对大肠杆菌的影响

相关性分析显示在各核黄素浓度下，光照强度与血浆中的大肠杆菌处理效果间呈较强的正相关（r2=0.45～1.00）（P=0.003 1～0.53）（图3）。

图3 各核黄素浓度下不同光照强度与大肠杆菌处理效果间的关系

4 不同核黄素浓度随时间变化对大肠杆菌的影响

在特定光照强度下，不同核黄素浓度对大肠杆菌的处理效果也随着光照时间的增加而增加，其中高浓度核黄素（300 µM）较低浓度核黄素（50 µM）对大肠杆菌有更好的处理效果，其在75 mW/cm2光照45分钟时两者对大肠杆菌处理效果上的差异可达2.22 log（图4）。

图4 各光照强度下不同核黄素浓度在各时间段对大肠杆菌的影响

相关性分析显示在50 mW/cm2和75 mW/cm2的光照强度下，核黄素浓度与血浆中的大肠杆菌处理效果间呈正相关（r2=0.84和0.66，P=0.084和0.19），而在100 mW/cm2高光照强度下，两者则无明显相关性（r2=0.01，P=0.87）（图5）。

图5 不同光照强度下核黄素浓度与大肠杆菌处理效果间的关系

讨 论

核黄素是一种多环平面结构的芳香族化合物，其有四个吸收峰，其中三个在紫外光波段，1个在可见光波段。当核黄素在符合其吸收峰的范围内受到光照能最大程度上激发其光化学反应，并通过反应中所产生的电子转移和氧化作用对病原体的核酸造成不可逆的损伤，从而阻止其复制和转录，达到灭活病原体的目的[10-11]。而紫外光因其良好的病原体灭活特性和熟知度而被广泛应用，如国外已投入应用的Mirasol病原体灭活系统主要依赖核黄素结合广谱紫外光（265～370 nm）对病原体进行灭活。然而由于紫外光携带更高的光子能量，其在对病原体产生更强杀伤的同时也会对血液成分的功能和质量产生负面影响[12-13]。此外，紫外光对塑料制品和碳氢化合物装置的破坏也是不可忽略的问题之一[14-15]。因此，考虑使用可见光作为另一种替代光源或许可以在一定程度上弥补紫外光在这些方面所存在的短板。以420 nm可见光为例，其同样处在核黄素的吸收峰之中，在被光照激活后有着和紫外光相似的光化学反应和光照产物[16]；其在病原体灭活方面也有着不俗的表现，已有研究证实可见光可有效灭活鼠白血病病毒（MLV），HBV，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌等病原体[17-20]；另外可见光本身发射的能量较小，有助于减小对血液成分的影响[21]。因此，这些优势和实验基础为本研究的开展提供了理论支持。

根据核黄素结合紫外光实验方法建立的相关研究发现，可能影响血液成分病原体处理效果的因素有包括光照强度、光照时间、核黄素浓度、细菌种类和浓度等[22-24]，这为本研究的设计提供了方法指引。为了更好地了解不同条件对核黄素可见光处理效果的影响，本研究主要对光照强度、光照时间、核黄素浓度进行重点研究，结果证实核黄素结合420 nm可见光对血浆中的大肠杆菌有一定的处理效果，综合来看，高强度的光照（100 mW/cm2）协同高浓度的核黄素（150 µM和300 µM）能够有效降低血浆中大肠杆菌的浓度达到4 log以上。根据时间效果曲线的分析，光照强度对大肠杆菌的处理效果有着重要影响，在同一核黄素浓度处理组中，接受高强度的光照处理在各时间点相较于低强度光照大肠杆菌梯度下降速度更快，浓度差异更大，而在较高的核黄素处理组中，这种差异更为显著，最大差异可达到2 log以上。相关性分析也证实光照强度与大肠杆菌的处理效果间存在明显的正相关，即大肠杆菌的处理效果伴随着光照强度的增加而增强。另一方面，核黄素浓度对大肠杆菌的处理效果也有一定的影响，不过这种影响范围较窄，主要体现在高浓度的核黄素处理组（150和300 µM）中，在部分时间段高浓度与低浓度核黄素对大肠杆菌处理效果上的差异也可达到2 log以上。进一步分析证实核黄素浓度与大肠杆菌的处理效果也存在一定相关性，虽然100 mW/cm2的高光照强度中并未体现出这一相关性，其原因可能是除了核黄素以外，其他物理因素如光照产生的热量也对大肠杆菌产生了影响。值得注意的是，在一些紫外光协同核黄素的相关研究中，50µM以上浓度的核黄素对VSV的影响很小，这与本研究中可见光协同核黄素的结果存在矛盾，推测这可能是因为紫外光的穿透力较差，而过量核黄素会阻止紫外线穿透至液体溶液的深层[25]，而可见光相较于紫外光有着更强的穿透力，因此能使更高浓度的核黄素发挥其病原体灭活的作用。

因此，根据目前的实验条件和数据，高强度光照协同高浓度核黄素在420 nm可见光的光照处理后可有效降低血浆中的大肠杆菌达4 log以上，这为今后进一步评估和完善病原体灭活方法的有效性，以及开发具有自主知识产权的核黄素光化学病原体灭活技术提供了一定的理论依据。该研究也存在一些局限性，首先研究中仅使用大肠杆菌作为实验菌，尚未评估该方法对多种细菌的处理效果；其次，目前尚未对血液成分的功能影响进行深入研究，根据周子瑜等人[20]的研究发现，在使用400～500 nm可见光对添加了1 500µM核黄素的含有HBV病毒的红细胞进行光照处理后能够显著降低病毒DNA拷贝数。同时，也未发现其对红细胞的功能产生显著影响，而其他相关研究也显示，接受405 nm可见光光照（无核黄素）5 h后的血小板虽然出现代谢变化（葡萄糖降低，乳酸增加）和线粒体呼吸功能的降低（基础呼吸，ATP产量，最大呼吸），不过都处在可接受范围，且可通过添加抗氧化剂改善血小板的线粒体状态[26]，这些积极的结果为后期的功能研究提供了良好的实践基础。最后，其他可能影响大肠杆菌处理效果的因素如细菌浓度、细菌种类、液面厚度、光照距离等并未纳入本次研究的考量范围，有必要进行进一步的深入研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突