血清miR-141对结直肠癌的诊断价值及根治性切除术后水平的变化

周岩 豆发福 周亚东 沈振

在许多疾病中,微小RNAs(miRNAs)似乎是一个很有前途的靶分子[1]。研究表明,人体各种体液中存在大量无细胞miRNAs,可用于结直肠癌(CRC)早期诊断及预后预测[2]。本研究采用微阵列分析和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证对CRC病人和非癌对照者的血清样本进行分析,识别最可能用于CRC筛查或早期检测的新型、基于血清的生物标志物。

对象和方法

一、对象

2019年4月～2021年3月我院CRC病人手术组织和血清样本75例(CRC组),男性40例,中位年龄67.8岁。同期20例因腹股沟疝而接受手术的病人组织和血清样本20例(对照组),男性14例,中位年龄65.2岁。CRC病人均行手术治疗,包括开腹手术、结肠切除术或仅进行组织病理学分析的活组织检查(不进行切除);均经病理和细胞学诊断证实。肿瘤体积为64.0 cm3(范围:1.0～1 650 cm3)。排除自身免疫性疾病、心血管疾病、严重肝肾疾病、血液病和传染病,以及服用免疫抑制药物者。本研究获得了医院机构审查委员的批准。所有研究者均签署书面知情同意书。

二、方法

1.标本采集:在术前24小时和术后第3天,采集5 ml空腹外周血样本,4 ℃下以1 500 r/min离心10分钟,储存在-80 ℃,待检。

2.血清和组织miRNAs提取:将1 ml血清或10 μg组织样本与750 μl Trizol LS试剂混合,纯化总RNA后,10 μl无核酸酶水溶解。采用NanoDrop N-100分光光度计和Quanti-iT核糖绿RNA分析试剂盒测定RNA浓度。采用Agilent 2100生物分析仪和小型RNA微阵列分析RNA质量。

3.miRNA微阵列分析:采用安捷伦miRNA标记试剂用pCp-Cy3标记总RNA,与人类miRNA寡核苷酸微阵列杂交。基因表达洗涤缓冲液试剂盒洗涤阵列,并用安捷伦DNA微阵列扫描仪扫描。采用特征提取软件对原始数据进行数字转换后,采用GeneSpring GX软件进行数据分析。将微阵列上斑点的信号强度标准化为阵列的总信号强度,并以百分比表示。

4.qRT-PCR验证 :采用MultiScribe逆转录酶和miRNA特异性引物对血清miRNA进行逆转录。采用TaqMan microRNA试剂盒和7300实时PCR系统通过实时PCR对miR-141进行定量。评估样本中miR-141相对检测水平,以2-ΔΔCT法计算。Cel-miR-39作为内标物。

三、统计学方法

采用SPSS 25.0软件分析数据。不符合正态分布的计量资料用中位值(四分位距)描述,采用Mann-Whitney检验或Wilcoxon检验。二分类变量用例(频数)描述,进行χ2检验。miR-142-3p诊断CRC的最佳截止值用受试者工作特征(ROC)曲线和曲线下面积(AUC)确定。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1.miRNAs微阵列分析:在所有检测的组织样本中,共检测到164个miRNA,其中CRC组织样本中69个miRNAs显著上调(P<0.05,图1A);此外,CRC血清样本中52个miRNAs的表达量高于对照组(P<0.05,图1B)。然而只有12种miRNAs同时在CRC组织和血清样本中表达上调,其中miR-141上调最显著(图1C)。

2.qRT-PCR检测血清样本中miR-141表达水平:CRC组病人术前血清miR-141相对表达量显著高于非癌对照组[2.50(1.06,3.12)vs.0.97(0.68,1.21),Z=-5.842,P<0.05]。经ROC曲线分析,术前血清miR-141用于诊断CRC的AUC为0.927(95%CI:0.862～0.992,图2A),当血清miR-141≥1.418时,用于区分CRC组和非癌对照组人群时的准确性为90.53%,敏感性和特异性分别为89.33%和95.0%。当血清癌胚抗原(CEA)和糖类抗原-199(CA-199)高于正常阈值(CEA≥5 ng/ml,CA-199≥37 U/ml)时,CRC诊断的准确性分别为62.11%和63.16%。联合检测血清miR-141、CEA、CA-199,可将常规肿瘤标志物(CEA+CA-199)的诊断AUC值提高至0.944(95%CI:0.899～0.998,图2B)。

A:血清miR-141诊断CRC的ROC曲线; B:血清miR-141、CEA、CA-19-9三者联合诊断CRC的ROC曲线图

3.手术对血清miR-141表达的影响:对照组术后血清miR-141相对表达量为0.84(0.74,1.02),与术前[0.97(0.68,1.21)]比较,差异无统计学意义(P>0.05)。CRC组术后血清miR-141相对表达量为1.90(1.32,2.28),低于术前[2.50(1.06,3.12),P<0.05]。对于CRC组病人,接受根治性切除者术后血清miR-141相对表达量显著低于术前[1.85(1.29,2.22)vs.2.55(2.07,3.18),P<0.05],对于未接受根治性切除术者,术后血清miR-141相对表达量略低于术前[2.28(1.72,2.74)vs.2.45(2.06,2.85)],但差异无统计学意义(P>0.05)。

4.CRC病人术前血清miR-141表达与临床病理特征的关系:根据血清miR-141表达水平的中位值,将CRC病人分为低表达亚组(≤2.50,37例)和高表达亚组(>2.50,38例)。CRC病人血清miR-141表达水平与肿瘤UICC分期、Dukes分期和组织学分级有关(P<0.05),与其他临床特征无关(P>0.05)。见表1。

表1 CRC病人术前血清miR-141表达水平与临床特征的关系(例)

讨论

miRNA在癌症中表达及临床意义是目前研究热点之一[1-2]。本研究结果表明,164种miRNAs在CRC组织中表达上调,然而其中多数miRNAs的内源性表达水平在CRC组血清样本中没有上调,这表明肿瘤组织和血清样本中miRNAs表达谱并不完全一致,CRC细胞似乎只是将一部分miRNAs分泌到体液循环中。miR-141是一种与癌症相关的miRNA,它在CRC组织样本和血清中均表达上调,这表明miR-141可能参与CRC的发生和进展,而且血清miR-141对于CRC诊断的准确性较高。

CRC细胞增殖、迁移和侵袭是一个多基因参与的过程,其中包括肿瘤抑制基因的失活和癌基因的激活[3]。miRNA可通过调节癌基因或抑癌基因,在肿瘤细胞增殖、侵袭、凋亡和耐药性等恶性过程中发挥重要作用[4-5]。研究表明,miR-141可以调节各种肿瘤细胞的生物学功能,但是不同组织中miR-141的调控作用存在较大差异。例如,与非骨转移性前列腺癌比较,miR-141在骨转移性前列腺癌中表达下调,且miR-141通过抑制前列腺癌骨转移中的NF-κB通路发挥肿瘤抑制作用[6]。Li等[7]研究发现,miR-141可抑制胶质瘤细胞的增殖并促进胶质瘤细胞的凋亡。有研究表明,miR-141在多种癌症中上调,并作为致癌miRNA发挥作用。Li等[8]研究发现,宫颈癌组织中miR-141表达高于正常宫颈组织。miR-141过度表达也被证明能促进鼻咽癌、卵巢癌和CRC的生长[9-10]。本研究发现,miR-141在CRC组织和血清中的表达上调,且与肿瘤分期和组织分化有关,说明miR-141可能是CRC诊断和治疗的候选靶点。

手术切除原发性肿瘤灶后,CRC血清miR-141水平显著下调,表明miR-141是由肿瘤细胞分泌的,当然并不能排除miR-141也由其他细胞分泌的可能性。ROC曲线确定miR-141的高灵敏度和特异性,说明其可作为诊断生物标志物的使用。当血清miR-141≥1.418时,区分CRC组和对照组人群的准确性为90.53%。而CEA、CA-199诊断的准确性仅为62.11%和63.16%[11],联合检测血清miR-141、CEA、CA-199可提高常规肿瘤标志物的临床诊断价值。

本研究证实了miR-141对于CRC的诊断有较高的准确性,但缺少随访证据,无法证实其在病人预后中的作用。本研究只能间接解释血清中部分miR-141来源于肿瘤组织,但是其来源问题尚不能完全明确。

总之,血清miR-141对CRC的诊断具有良好的敏感性和特异性,联合常规肿瘤标志物检测可提高常规肿瘤标志物的诊断准确性。