miRNAs对食管癌发生发展的影响及中医药的干预作用

李晨辉，彭孟凡，孔小莉，白明*，苗明三*（.河南中医药大学，郑州 450046；.黄淮学院，河南 驻马店 463000）

食管癌是常见恶性肿瘤，统计显示，其患病率和死亡率在全球恶性肿瘤中分别居第七位和第六位[1]。早期的食管癌症状不明显，且病灶局限，影像学检查检出率及准确性有限，肿瘤标志物检测（CYFRA21-1、CEA、SCCA、p53蛋白抗体等）的特异性与灵敏度也不高，不利于早期食管癌的诊断和治疗[2]。MicroRNAs（miRNAs）是由18～24个核苷酸组成的内源性非编码小分子RNA，是近年来肿瘤检测标志物和肿瘤研究领域的一大热点。miRNAs可通过与长链非编码RNA（lncRNA）、环状RNA（circRNA）、信使RNA（mRNA）、蛋白分子等相互作用，参与调控细胞的增殖、周期、分化、凋亡等生理过程，介导包括食管癌在内的多种恶性肿瘤的发生与发展[3]。

中医药在食管癌的防治、预后等方面效果明显，可增强临床疗效，提高患者生活质量[4]。近年来，中医药通过miRNAs干预肿瘤进展的研究日益增多，因此，文章就miRNAs在食管癌发生发展中的双重调控机制及中医药经miRNAs干预食管癌的作用机制进行系统综述，旨在为食管癌的临床诊断、治疗和预后评估等提供新思路。

1 miRNAs的概述

miRNAs是在动物、植物和一些病毒中发现的一类非编码RNA，第一个人类miRNAslet-7于2000年被发现，目前已有2000多种人类miRNAs在数据库中被注释[5]。miRNAs可通过与特定的功能蛋白形成RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）来调控细胞的生物过程，其调控途径主要为与mRNA碱基、靶片段互补配对，抑制靶基因翻译，以及调控靶基因启动子CpG岛（CpG island）的甲基化来影响靶基因的转录[6]。miRNAs在恶性肿瘤中发挥着重要作用，miRNAs既可作为促癌基因参与食管癌的发生，诱导肿瘤细胞放化疗抵抗，减弱临床治疗效果，促进肿瘤细胞无限增殖、侵袭和转移等多种恶性生物学行为；又可作为抑癌基因降低食管癌的发生率，阻断其恶性发展[7]。部分参与的miRNAs如表1所示。

表1 部分miRNAs对食管癌的影响Tab 1 Impact of part of miRNAs on esophageal cancer

2 miRNAs对食管癌发生发展的影响

2.1 miRNAs对食管癌动物模型的影响

体内动物实验表明，过表达miRNAs-200c的Eca109细胞皮下成瘤的肿瘤的体积和重量与Eca109细胞相当，放疗可以降低皮下瘤的体积和瘤重。miRNAs-200c可通过抑制细胞周期蛋白B1（Cyclin B1）、细胞分裂周期基因cdc2（cell division cycle gene，cdc2）和促进P21蛋白表达抑制体内肿瘤进展，具体表现为，过表达miRNAs-200c的Eca109细胞皮下成瘤的肿瘤的体积和重量经放射治疗后均显著低于Eca109细胞皮下瘤[8]。Yang等[9]发现，与顺铂抵抗食管癌细胞株OE19/CDDP相比，过表达miR-181a-5p的细胞株OE19/CDDP具有更小的肿瘤体积和瘤重，且经顺铂治疗后，后者肿瘤体积减小和瘤重降低更为显著。Li等[10]发现，过表达miR-29c的细胞株KYSE410FR皮下成瘤能力较KYSE410弱，且经氟尿嘧啶（5-FU）治疗后，前者皮下瘤体积显著减小，表明miR-29c可在体内水平促进肿瘤细胞对5-FU的敏感性，增强抗肿瘤效果，且该作用是通过靶向结合FBXO31mRNA进而升高肿瘤组织cleaved caspase-3、p-p38和降低Ki67蛋白实现的。Wu等[11]发现，顺铂干预可抑制食管癌细胞Eca109的皮下成瘤能力，减小肿瘤体积和降低瘤重。与顺铂比，干扰Eca109细胞miR-10b表达后联合顺铂治疗更能显著减小肿瘤体积和降低瘤重。

2.2 miRNAs对离体食管癌的影响

2.2.1 miRNAs对食管癌细胞的影响 分化抑制因子3（ID3）在食管癌中扮演致癌基因的角色，可通过激活ERK/MAPK通路诱导食管癌细胞增殖、迁移、侵袭等恶性生物学行为[12]。体外实验表明，miRNAs-340-5p能通过结合ID3 3'-UTR端在转录和翻译水平降低ID3表达，从而抑制食管癌Eca109细胞增殖、迁移和侵袭[13]。GEPIA数据库中临床数据表明，lncRNA DLEU2在食管癌组织中高表达，并与患者不良预后相关，还可在体外促进食管癌细胞Eca-109和KYSE-150恶性表型。miR-30e-5p可通过内源性结合lncRNA DLEU2解除其对转录因子-7（E2F7）的正调控作用，抑制食管癌细胞增殖、迁移和侵袭，增加细胞凋亡[14]。

相反，部分研究表明miRNAs在食管癌中发挥抑癌作用。miR-301a-3p参与多种肿瘤的发病，包括食管癌，其在正常食管黏膜细胞系Het-1A中的表达显著低于食管癌细胞Eca109和TE-1，过表达miR-301a-3p则可显著增强Eca109细胞增殖能力和克隆形成率，该作用是通过miR-301a-3p靶向PTEN基因的3'-UTR端，进而抑制PTEN/PI3K/AKT通路实现的。而抑制miR-301a-3p表达，则可抑制PTEN/PI3K/AKT通路、降低Bcl-2蛋白、升高Bax蛋白，从而抑制Eca109细胞的增殖[15]。高栋才[16]发现，食管癌TE-1细胞中miR-103a-2-5p的表达低于KYSE-150细胞，在TE-1细胞中过表达miR-103a-2-5p可增加其增殖、侵袭和迁移能力，而敲低KYSE-150细胞miR-103a-2-5p可抑制其增殖、侵袭和迁移能力。进一步研究表明，与高水平miR-103a-2-5p的外泌体共培养也可促进食管癌细胞TE-1和KYSE-150的增殖、侵袭和迁移。

2.2.2 miRNAs对肿瘤相关巨噬细胞的影响 肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是在肿瘤组织中浸润的巨噬细胞，具有异质性，常具有M1型和M2型两种分化状态，一般而言，M1型具有抗肿瘤作用，M2型具有促肿瘤作用。现有研究表明，miRNAs在巨噬细胞的分化和活性维持中具有重要作用。miR-21-5p在EC109及其外泌体中高表达，同时miR-21-5p可由外泌体作为传递介质，被巨噬细胞摄取，抑制巨噬细胞吞噬功能，促进巨噬细胞增殖和极化为M2型。EC109 细胞转染miR-21-5p mimic与巨噬细胞共培养可增加转化生长因子-β（TGF-β）、白细胞介素（IL）-10、CD206 mRNA、CD209 mRNA等M2型巨噬细胞标志物表达，促进其向M2型极化。此外，抑制M2型巨噬细胞miR-21-5p可抑制其表型M2型。而且外泌体miR-21-5p诱导的M2型巨噬细胞可通过释放TGF-β，进而激活食管癌细胞TGF-β/Smad2/EMT通路，促进其迁移、侵袭能力[17]。

相反，miR-34a、miR-543、miR-765等可通过抑制巨噬细胞M2型极化，发挥抗食管癌作用。如盖宇等[18]发现，miR-34a在M2型巨噬细胞中的表达显著低于M1型，过表达miR-34a可显著降低M2型巨噬细胞标志物CD206、CD163、CCL18、CCL22等的表达，抑制巨噬细胞向M2型极化。将过表达miR-34a的M2型巨噬细胞与食管癌细胞共培养后，可显著抑制EC109细胞的迁移能力，增加其早期和晚期凋亡率。过表达circRNA TCFL5可通过诱导巨噬细胞向M2型极化促进食管癌细胞Eca109和KYSE150的增殖、侵袭和迁移，而miR-543 mimics则可通过靶向结合circRNATCFL5，抑制巨噬细胞向M2型极化，最终抑制食管癌细胞的恶性生物学行为[19]。lncRNA RP11-465B22.8参与食管癌的发生和发展，在食管癌组织中高表达。在食管癌细胞TE-1和KYSE150中转染miR-765 mimics可通过靶向吸附lncRNA RP11-465B22.8减弱其对M2型巨噬细胞的极化作用，消除其对食管细胞增殖、迁移和微管形成的增强作用[20]。

2.2.3 miRNAs对食管癌细胞放疗抵抗的影响miRNAs通过调节细胞凋亡、与放射相关的通路和细胞周期进程等方式，参与对肿瘤细胞放射敏感性的调控。其中，调控细胞周期是miRNAs影响肿瘤细胞对放疗敏感性的主要方式。研究表明，相比正常KYSE150细胞，放疗抵抗性食管癌KYSE150细胞（KYSE150R）的细胞周期在G0/G1期受阻、Cyclin D1蛋白水平降低，而miR-193b水平升高。免疫荧光素酶报告实验表明，miR-193b可通过靶向结合Cyclin D1的3'-UTR端使细胞阻滞于G0/G1期，进而降低食管癌细胞的敏感性[21]。

相反，miRNAs-200c在放疗抵抗食管癌患者肿瘤组织及Eca109细胞中低表达，过表达miRNAs-200c可通过下调Cyclin B1、P21和升高P21蛋白诱导细胞周期阻滞，尤其是G2/M期和亚G1期阻滞，从而增强Eca109细胞放射敏感性[8]。miRNAs-30a-3p在EC9706和EC109细胞株中表达显著低于食管正常上皮细胞，并与肿瘤细胞的放射敏感性有关，即miRNAs-30a-3p可通过靶向食管癌细胞 IGF-1R的3'-UTR端降低IGF-1R mRNA和蛋白表达提高EC9706和EC109对射线的敏感性，从而降低基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9蛋白表达，使细胞阻滞于G1期，抑制细胞增殖，降低EMT标志蛋白N-cadherin和vimentin表达，升高E-cadherin蛋白表达，发挥抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移能力[22]。过表达miR-301a介导的WNT1抑制能通过降低转录因子4（TCF4）和Cyclin D1的mRNA表达干扰细胞周期，从而增强KYSE150R细胞对放射线的敏感性，抑制细胞活力和侵袭能力。反之，干扰miR-301a可降低放射敏感性KYSE150细胞对放射线的敏感性，增强其增殖和迁移能力[23]。

2.2.4 miRNAs对食管癌细胞化疗抵抗的影响食管癌在诊断时多处于中晚期，错过手术治疗的最佳时机，临床多采用化疗结合放疗的手段进行治疗。然而，在持续性治疗中，机体常产生一定的耐药性，肿瘤细胞对药物的敏感性降低，难以维持治疗。miRNAs作为肿瘤治疗的新兴靶点，在食管癌化疗抵抗中发挥重要作用。彭洁[24]研究发现，紫杉醇处理的耐药食管癌TE-1细胞中18个miRNAs上调，28个miRNAs下调。沉默miR-378d后的细胞系 TE-1、KYSE150较对照组细胞均有显著的5-FU和顺铂耐药性，表现为细胞半数致死量升高、克隆形成能力增强、细胞骨架重排（肌动蛋白丝骨架以及更延展的形态）、以TE-1细胞系差异最显著。双荧光素酶基因报告表明，沉默miR-378d而导致的细胞化疗药物抵抗是由于miR-378d水平降低，其靶向结合AKT基因的3'-UTR抑制AKT-β-catenin通路作用减弱而导致的。miR-29c在5-FU耐药食管癌细胞（KYSE150FR、KYSE410FR）水平较亲本细胞KYSE150、KYSE410显著降低，过表达miR-29c可逆转KYSE150FR和KYSE410FR细胞对5-FU的耐药性，抑制细胞增殖和活性。相反，敲低miR-29c可进一步加重KYSE150、KYSE410细胞对5-FU的抵抗性，增强细胞活力和增殖能力[10]。

相反，miR-21在食管癌细胞株TE-1和Eca109/CDDP（顺铂抵抗细胞株）中表达显著高于正常食管上皮细胞Het-1A，且在顺铂抵抗的癌细胞株中表达更高。过度表达miR-21可降低食管癌细胞对顺铂的敏感性，抑制miR-21可增强TE-1对顺铂的敏感性，双荧光素酶报告证实，miR-21降低食管癌细胞对顺铂的敏感性是通过靶向程序化细胞死亡4（PDCD4）基因的3'-UTR端进而抑制其转录和翻译产物实现的[25]。较之正常食管上皮细胞和组织，miR-10b在食管癌细胞EC109、TE10和组织中高表达，且miR-10b介导的PPARγ抑制能通过激活AKT/mTOR/P70S6K信号通路，增强肿瘤细胞的顺铂抵抗。干扰miR-10b表达可增强肿瘤细胞对顺铂的敏感性，从而抑制EC109和TE10细胞活力和克隆形成能力、降低顺铂的半抑制浓度（IC50）值、抑制Bcl-2蛋白表达、升高Bax蛋白表达，最终促进肿瘤细胞凋亡[11]。

综上，部分参与的miRNAs对食管癌的影响的汇总情况见表1。

3 中医药经miRNAs干预食管癌的作用机制

食管癌属中医学“噎膈”范畴，是“风、痨、臌、膈”四大顽症之一。“噎膈”病因复杂，体虚外感、七情内伤、饮食不节等致气、痰、瘀、热交阻，津气耗伤，食管梗阻成病。中医药防治食管癌以辨证论治为主，在应用方面涉及单味中药及有效成分、中药复方等，多从清热解毒、化痰散瘀、益气活血、解毒散结等方面入手，结合手术、放疗或化疗，以降低术后不良反应、减轻放化疗抵抗和相应不良反应的发生率[26]。

3.1 中药单味药及提取物

藤梨根是猕猴桃科植物中华猕猴桃植物的干燥根，首次记载于《开宝本草》。现代研究表明，藤梨根活性成分对多种恶性肿瘤有防治作用，其抗肿瘤机制主要包括抑制肿瘤细胞增殖生长、诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期，抑制肿瘤血管生成等[27]。研究显示，藤梨根提取物在一定浓度范围内可以上调miR-451的表达水平，从而对细胞株内CDKN2D、AKT、BCL-2等DNA表达基因进行调节，肿瘤细胞的分裂多停留在DNA合成前期，进而削减细胞的侵袭能力，促使肿瘤细胞凋亡速度加快[28-29]。

毛叶香茶菜是一种少见的中草药，其活性提取物表诺多星（epinodosin，EP）是具有抗肿瘤活性的五环二萜类化合物。李亚妹[30]发现，EP在4种食管鳞癌细胞中均可诱导miR-143-3p的表达，降低靶向基因Bcl-2的表达量；此外，还可显著抑制MAPKs信号通路蛋白p-ERK1/2、p-JNK、p-p38的表达，抑制MAPKs信号通路的激活，抑制食管鳞癌细胞的增殖、迁移与侵袭。

南蛇藤是我国传统中药，在我国分布广泛，其根、茎、叶均可入药，具有活血、解毒、祛风、消肿的功效。于耀洋等[31]将miR-302体外转染至食管癌TE-1细胞，与南蛇藤提取物（COE）联合作用于TE-1细胞，发现COE和过表达miR-302可抑制PI3K/Akt信号通路的激活，从而抑制TE-1细胞增殖、侵袭和迁移，且两者联合使用效果强于单一因素作用。提示COE联合miR-302能够协同抑制食管癌TE-1细胞增殖、侵袭和迁移。

丹参酮ⅡA（tanshinone IIA，TSⅡA）是丹参的主要有效成分之一，向文杰[32]发现将其与硒-甲基硒代半胱氨酸（se-methylselenocysteine，MSC）联合使用能显著上调抑癌基因miR-203a-3p的表达水平，且相比于同等剂量的丹参酮ⅡA差异有统计学意义，miR-203a-3p能调控GATA6从而抑制ESCC细胞的增殖和侵袭，而MSC显著有效地放大了丹参酮ⅡA对肿瘤细胞增殖活力的抑制能力，miR-203a-3p很有可能是发挥该作用的重要因子。

3.2 中药复方

启膈散记载于《医学心悟》，为治疗“噎膈”之名方，临床常用于食管癌的治疗，其药方含丹参、沙参、川贝母、茯苓、砂仁、郁金，为行气化痰法代表方剂。miR-133a/PI3K/Akt等信号通路是影响食管鳞癌发生、发展的重要信号通路。研究显示，启膈散能通过调控食管癌EC9706细胞miR-133a/PI3K/Akt信号环路甲基化，促进miR-133a在肿瘤细胞的表达，抑制PI3K/Akt信号通路的激活；下调哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的蛋白表达，抑制食管癌EC9706细胞的增殖[33-34]。启膈散与顺铂联用在抑制食管癌细胞EC9706增殖方面具有协同作用，其机制可能与抑制miR-21表达从而升高PDCD4和PTEN基因表达相关[35]。

六君子汤作为健脾和胃的经典代表方，临床应用广泛，是治疗和辅助治疗食管癌的有效方药，其搭配营养管理能够减轻患者放化疗毒副作用，改善患者的营养和免疫状态[36]。miR-34a/STAT3/IL-6R反馈环在多种类型肿瘤中存在，与癌症的侵袭与转移、免疫抑制等相关，六君子汤可通过提高miR-34a的表达，逆转IL-6R/STAT3信号通路介导的miR-34a抑制，从而抑制免疫检查点PD-L1的表达，抑制免疫逃逸，调节机体免疫反应，介导肿瘤的发生发展，参与肿瘤微环境免疫抑制[37]。

消癌解毒方是国医大师周仲瑛教授结合多年临床经验总结而形成的有效验方，抗肿瘤效果显著，该方与化疗药联用，有提高肿瘤化疗疗效的作用。丁艳[38]发现，食管癌患者血清中miR-223-3p和miR-151a-5p高表达，并与淋巴结转移和肿瘤浸润深度有关，中药消癌解毒方联合放疗可降低患者血清中miR-223-3p和miR-151a-5p水平，减轻临床症状，提高生活质量。

综上，不同中药抑制食管癌的作用机制归纳总结见表2。

表2 不同中药通过miRNAs抑制食管癌的作用机制Tab 2 Mechanism of different Chinese medicines in inhibiting esophageal cancer via miRNAs

4 总结和展望

食管癌发病隐匿、早期症状不典型，是导致其确诊时已处于中晚期的主要原因，因此有必要寻找敏感性高的生物标志物，以便在食管有癌变趋势或肿瘤早期进行干预，降低食管癌发病率和减缓恶性进展速度。miRNAs在基因表达调控中起着至关重要的作用，更是肿瘤诊断、治疗和预后的潜在标志物和治疗靶点。中医药作为我国传统医学中的特色，可调控相关miRNAs影响Bax/Bcl-2、ERK/MAPK、AKT/mTOR/P70S6K、PTEN/PI3K、TGF-β/Smad2/ EMT等信号通路，肿瘤微环境中巨噬细胞与肿瘤细胞交叉通路等参与食管癌的发生发展，为临床治疗提供新方法、新思路。