GSK-3介导的信号通路在类风湿关节炎中的作用的研究进展*

陆 婷,蒋 总,兰维娅,唐 芳

(1.贵州中医药大学,贵阳 550002;2.贵州中医药大学第二附属医院风湿免疫科,贵阳 550003)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种自身免疫性骨关节疾病,以慢性炎症、滑膜细胞异常增生为特征,可引起关节炎症和骨破坏,导致关节功能受限[1]。在RA的发展过程中,许多不同的信号通路发挥着重要作用。因此,对RA病理机制的深入研究有助于有效的抗类风湿药物的开发。糖原合成酶激酶3(glycogen synthase kinase-3,GSK-3)是一种能诱导和终止炎症的激酶,广泛存在于各种炎症细胞中,参与多种信号通路的调节[2]。虽然RA的发病机制尚不清楚,但研究证实RA患者自身免疫活跃,炎症趋化因子异常刺激,促使炎症因子水平升高而加快RA病情进展,而促炎细胞因子的产生主要依赖于GSK-3的活性,RA中观察到的炎症因子与各种促炎介质和转录因子已被证明与GSK-3密切相关[3]。同时也有较多信号通路被异常激活或抑制,其涉及多种蛋白的异常表达,而GSK-3就是比较重要的一种,所以RA的治疗可能侧重于减少免疫反应和炎症反应[4]。GSK-3β在RA中研究较充分,因此本文总结了关于GSK-3β与RA的相关炎症因子紧密联系的Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)、磷酸酰肌醇3激酶(phosphotylinosital 3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)及核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信号通路机制的探讨,以期为RA的治疗提供更多的理论依据。

1 GSK-3概述

GSK-3最早是从兔骨骼肌中分离得到,并在哺乳动物中鉴定出两种高度同源的GSK-3,即GSK-3α和GSK-3β。氨基酸序列比较表明,二者在催化区域有98%的同源性,而整体同源性约为85%。GSK-3α和GSK-3β在调控和表达上存在一定差异,具有共同或不同的底物和细胞功能,不能完全替代对方,其主要表现在于N和C端不同,GSK-3α和GSK-3β分子量的差异是由GSK-3α N端富含甘氨酸的延伸引起的。而GSK-3α和GSK-3β C端最后76个氨基酸的同源性仅为36%[2,4]。在调控上,GSK-3活性被丝氨酸(Ser)21、Ser9磷酸化而抑制和被苏氨酸(Tyr)279、Tyr216磷酸化而激活。同时,研究证实GSK-3α敲除小鼠可以存活,但GSK-3β缺失会导致胚胎死亡[3],表明GSK-3α和GSK-3β的功能不完全相同。

GSK-3活性受自身磷酸化水平的影响,除最早发现的能调控糖原合成酶的活性外,GSK-3还作用于众多信号通路和转录因子中,调节细胞的分化、增殖、存活和凋亡[2]。同时GSK-3作为众多信号通路下游的关键因子,可广泛参与细胞过程,如从糖原代谢到血管生成、细胞生存和炎症反应的调节等[4]。GSK-3在炎症和免疫疾病中参与调节炎症因子,如白细胞介素(IL)-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等[3]。

2 不同信号通路对RA的影响

2.1 Wnt/β-catenin信号通路

Wnt信号通路与RA的发生、发展密切相关。经典信号通路在缺乏Wnt配体参与时,GSK-3β与轴蛋白/结肠腺瘤样息肉病基因编码的蛋白/酪蛋白激酶1形成降解复合体,磷酸化β-catenin,β-catenin被泛素蛋白酶识别并降解,抑制Wnt信号通路的激活。当Wnt配体参与时,其与卷曲蛋白(frizzled,FZD)和单跨膜分子低密度脂蛋白受体相关蛋白(low density lipoprotein-related protein,LRP)5/LRP6形成Wnt/FZD/LRP复合体,招募散乱蛋白,捕获轴蛋白(Axin)结合的GSK-3β复合物,稳定β-catenin并使其进入细胞核,与T细胞因子(T cell factor,TCF)/淋巴样增强因子(lymphoid enhancer factor,LEF)转录因子家族相互作用,激活下游靶基因而发挥作用[5]。

Wnt/β-catenin信号通路通过促进细胞增殖、迁移、侵袭和炎症参与RA成纤维细胞样滑膜细胞(fibroblastlike synoviocyte,FLS)的激活,激活的FLS可产生和分泌TNF-α、IL-1β、IL-8等炎症因子,最终导致滑膜炎和关节损伤,而FLS产生的炎症因子也能激活Wnt信号通路,导致RA的炎症反应[6]。Wnt5a、Wnt7a、Wnt10b作为Wnt/β-catenin信号通路的配体,能在FLS的增殖过程中大量释放炎症因子,加快RA病情进展[7]。Wnt1是纤维连接蛋白(fibronectin,Fn)生成的主要Wnt配体之一,能够调节RA-FLS中β-catenin下游Fn的表达,而Fn提高了FLS的生存,从而加重了RA的炎症反应[6]。RA-FLS作为滑膜组织中参与RA发展的主要细胞群,抑制RA-FLS的侵袭、迁移和炎症可作为治疗RA的手段之一。除炎症作用外,Wnt信号通路在RA成骨细胞(osteoblast,OB)和破骨细胞(osteoclast,OC)的平衡中具有重要的调节作用。(1)Dickkopf-1(DKK1)作为Wnt/β-catenin信号通路的拮抗剂在RA中能加剧FLS介导的炎症、骨破坏和血管生成,当其在RA患者的血清和滑膜液中过表达时,通过抑制Wnt/β-catenin信号通路而抑制OB分化,间接使OC分化增加,加剧RA患者的骨破坏[7]。(2)Wnt/β-catenin信号通路对骨保护素(osteoprotegerin,OPG)/核因子-κB配体受体激活剂(oeceptor activatorfor nuclearfactor-κB ligand,RANKL)的表达起重要调控作用,Wnt/β-catenin信号通路能增强OPG的表达,而RANKL诱导OC生成,OPG通过阻断RANKL与RANK的结合抑制OC生成,改善RA的骨破坏。(3)DKK1通过抑制OPG的过表达,提高RANKL水平,抑制Wnt/β-catenin信号通路对OB和OC的调节,保持RA骨代谢的稳态[8]。

RA的发病机制较复杂,目前仍处于研究阶段,而Wnt/β-catenin信号通路上不同因子通过不同的机制作用于RA,也从不同方面影响着RA的进展及预后。

2.2 GSK-3β介导的Wnt/β-catenin信号通路

GSK-3作为关键的调控因子,同时也被多种因子调节。最常见的是GSK-3β结合蛋白,在体内的功能是稳定β-catenin。Axin与抗原提呈细胞(antigen-presenting,APC)作为GSK-3β的底物,GSK-3β能磷酸化Axin并提高其稳定性,同时更有利于β-catenin与APC之间的相互作用,使GSK-3β磷酸化β-catenin[9]。因此,GSK-3在Wnt/β-catenin信号通路中主要由GSK-3β参与进行磷酸化,GSK-3β在β-catenin降解复合体中作为一个关键酶,能够调控Wnt信号通路的激活或失活。进一步说明了GSK-3在Wnt/β-catenin信号通路中的中心作用。

微RNA-26b(miR-26b)在抑制RA的滑膜炎中发挥核心作用。研究证实,miR-26b通过降低GSK-3β水平使Ser9-GSK-3β磷酸化水平下降而提高β-catenin和细胞周期蛋白1(CyclinD1)表达,抑制Wnt/GSK-3β/β-catenin信号通路,减少RA-FLS增殖和炎症因子分泌而抑制RA滑膜炎[10]。氯化锂(LiCl)作为GSK-3β抑制剂,可以增强GSK-3β在Ser9位点的磷酸化水平并促进β-catenin在核内的积累,而7-羟基香豆素(7-HC)在体外阻止β-catenin的核转位。LiCl与7-HC联合使用恢复了β-catenin信号通路的活性,并抑制7-HC对TNF-α诱导的RA-FLS的抗增殖和促凋亡作用,说明7-HC抗RA进展是通过抑制Wnt/β-catenin信号通路介导[11]。所以,GSK-3β通过介导Wnt/β-catenin信号通路可以诱导RA的进展,进一步表明GSK-3β在Wnt/β-catenin信号通路中不可忽视的作用。

2.3 PI3K/Akt信号通路

PI3K主要由p110催化亚单位和p85调节亚单位组成。PI3K可被G蛋白偶联受体和(或)蛋白酪氨酸激酶受体激活,也可被Ras蛋白激活。Akt作为PI3K信号通路的下游靶点,当PI3K激活后在质膜上将磷脂酰肌醇(4,5)二磷酸[phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate,PIP2]磷酸化并产生磷脂酰肌醇(3,4,5)三磷酸[phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate,PIP3],Akt的PH结构域与PIP3结合,PIP3依赖性激酶-1在被PIP3活化的同时定位于细胞膜,进一步催化Akt的Thr473和Thr308磷酸化,Akt由此被完全活化,活化的Akt使大量下游底物磷酸化,参与调节细胞存活、凋亡、增殖等[12]。

PI3K/Akt信号通路在RA中参与了多个环节的发生,如调控炎症因子的释放,促进OB的生成等。PI3K/Akt信号通路的异常激活是RA的主要调节因子,能诱导RA炎症反应的发生,而炎症因子也能通过激活PI3K/Akt信号通路来介导RA的进展[8]。PI3K/Akt可以通过作用于雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制RA-FLS自噬,使FLS异常增殖,加重RA病情[7]。同时,PI3K/Akt信号通路抑制剂或者通过上调其内源性负调节蛋白的水平,而抑制RA-FLS增殖,缓解RA的发展[11]。RA-FLS通过产生TNF-α、IL-6、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和基质金属蛋白酶诱导炎症反应,导致PI3K/Akt信号通路转导异常,引起滑膜炎和FLS释放,最终导致RA的软骨破坏和骨侵蚀,影响OB的分化和生成[8]。VEGF作为血管生成的关键调控因子,能诱导RA滑膜中的促炎细胞因子产生,而PI3K/Akt信号通路在炎症反应及缺氧下能够促进VEGF的表达。研究证实,紫草素通过下调PI3K/Akt信号通路抑制VEGF诱导的血管生成,从而缓解RA滑膜炎和血管翳的形成[13]。通过调控PI3K/Akt信号通路相关蛋白可以诱导RA-FLS细胞凋亡,控制RA的症状和发展[11]。PI3K/Akt信号通路可从不同作用、不同方面缓解RA的炎症反应。

2.4 GSK-3介导的PI3K/Akt信号通路

GSK-3作为PI3K/Akt途径的下游成分,当PI3K/Akt激活时使Ser21处的GSK-3α和Ser9处的GSK-3β磷酸化,导致GSK-3失活。在特定情况下Akt和GSK-3可以协同调控信号通路,GSK-3也可以调节一些GSK-3抑制激酶的作用。这种双向性的研究主要集中在Akt和GSK-3的相互作用中,Akt不仅抑制GSK-3,而且GSK-3也可以调控Akt,如GSK-3α还可以通过Ser312-Akt调控位点的磷酸化抑制Akt的活性[14]。IL-10是一种抑制炎症基因表达的免疫抑制细胞因子,PI3K/Akt信号通路能诱导其产生,而Akt下游的GSK-3激酶作为IL-10的抑制剂,当GSK-3磷酸化和失活时使IL-10从GSK-3的抑制中释放出来并过表达,抑制促炎细胞因子,增强抗炎机制,缓解RA的炎症反应[15]。

SHARMA等[16]通过药理实验证实,小檗枸杞提取物(BLFE)和小檗碱的PI3K、Akt激活均减弱,而GSK-3β激活仅在BLFE和小檗碱给药组观察到抑制。GSK-3β在PI3K/Akt信号通路中能改善RA的临床症状,为PI3K/Akt-GSK-3信号通路治疗RA提供了新的方向及理论依据。

2.5 NF-κB信号通路

NF-κB是一种由3个亚基[p65、p50和抑制剂kappa B(IκB)]组成的转录因子,多种细胞内外刺激可直接或间接激活NF-κB信号通路。NF-κB信号通路由两种途径进行激活:(1)典型的NF-κB信号通路由促炎信号(细胞因子受体,如IL-1R和TNF-α家族)、Toll样受体(TLR)和淋巴细胞受体参与激活。其传导的关键是三聚体IκB激酶复合物对IκBα的磷酸化,以释放RelA:p50二聚体,使其易位到细胞核以激活靶基因。(2)非典型的NF-κB信号通路,由NF-κB的必要调节蛋白(NEMO)和催化激酶亚基(IKKβ)独立的IKKα二聚体复合物介导,从而间接激活与之相关的其他细胞途径,如丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、免疫球蛋白(Rho)等[17]。NF-κB信号通路被认为是细胞因子与炎症反应之间的桥梁,而RA作为一种炎症相关疾病与NF-κB信号通路的过度激活有关[18]。NF-κB信号通路作为RA的主要炎症途径之一,在所有细胞类型中普遍表达和被激活,并与其他信号通路之间相互作用,在调节炎症、免疫和细胞增殖、分化、生存方面发挥着关键作用。高度激活的NF-κB信号通路可诱导多种促炎细胞因子如TNF-α、IL-1β和IL-6的产生,从而加速RA的进展。而促炎细胞因子的上调也可以通过正反馈调节NF-κB信号通路的激活,形成恶性循环,加速RA的发展[19]。

活化的NF-κB信号通路可促进FLS增殖,增强其侵袭、浸润能力。在RA的滑膜炎环境中,FLS凋亡异常是RA滑膜增生的主要因素。凋亡异常的FLS进一步聚集并黏附在软骨和骨上,加剧关节软骨和骨的破坏[18]。而NF-κB信号通路的过度激活会导致RA中FLS凋亡异常,相反,抑制NF-κB可明显减轻炎症反应[20]。药理实验证实,早期RA患者的炎症可使用氨甲蝶呤(MTX)来治疗,MTX治疗由NF-κB信号通路介导,MTX可以通过增加RA患者NF-κB抑制物A20(TNFAIP3)的表达来抑制巨噬细胞的炎症反应[21]。而泼尼松龙是一种合成糖皮质激素,通过NF-κB信号通路抑制炎症基因激活,临床上用于缓解RA的炎症治疗[22]。可见,临床上通过药物来抑制NF-κB信号通路,或者通过该通路抑制相关炎症因子的表达,进一步改善RA的进展。

2.6 GSK-3介导的NF-κB信号通路

RA患者炎症细胞因子表达较高,它们既是NF-κB信号通路的靶基因,又是激活因子。TNF-α能够调节GSK-3,促进NF-κB信号通路反馈抑制,使炎症细胞因子减少。而GSK-3β参与多种事件,如激活NF-κB信号通路、阻止IκB的降解、抑制p65的核转位及降低p65的磷酸化水平[4]。说明抑制GSK-3β可抑制NF-κB信号通路的激活。而GSK-3β可以选择性激活NF-κB信号通路,如NF-κB介导的IL-6和单核细胞趋化蛋白-1的表达需要GSK-3β才能有效表达,而IκBα和巨噬细胞炎症蛋白-2则不需要。GSK-3β对NF-κB信号通路诱导的基因表达的这种选择性作用可能有助于GSK-3抑制剂的抗炎作用,同时表明GSK-3的抑制不会干扰NF-κB信号通路的所有作用[23]。

研究发现,在RA小鼠模型中随着NF-κB信号通路的激活,炎症细胞因子表达增加,使用GSK-3β抑制剂TDZD-8后,下调了RA-FLS中NF-κB信号通路,抑制了c-Jun N末端激酶(JNK)、c-Jun、活化转录因子(ATF)2和p38的表达,从而抑制RA的炎症反应[24]。NF-κB信号通路是一种有效的炎症因子和转录因子,在胶原诱导性关节炎(CIA)的动物模型中GSK-3β和NF-κB信号通路的同时激活是RA动物炎症和滑膜增殖过程中的主要关键因素,在RA动物模型中,GSK-3β的抑制通过抑制NF-κB信号通路的激活提供保护[20]。药理实验表明,阿托伐他汀和槲皮素的联合治疗进一步促进了miR-26b和miR-20a表达的升高,从而抑制GSK-3β/NF-κB/活化的NOD样受体蛋白3(NLRP-3)信号通路,导致促炎细胞因子的减少,在RA中发挥抗炎作用[25]。

NF-κB信号通路可以被一个或多个复杂的信号通路激活,这些信号通路之间也可以相互影响。GSK-3β对NF-κB信号通路具有不同的调节作用,主要以其对RA炎症作用为主,但相关实验研究较少,所以在RA中的作用机制需进一步探讨。

3 小 结

RA发病机制复杂,目前仍不能明确其发病机制。而信号通路为RA的治疗提供了明确的治疗靶点,Wnt/β-catenin、PI3K/Akt及NF-κB信号通路与炎症因子相互作用共同促进RA的发展。GSK-3作为一种能够调节多种靶分子丝氨酸和苏氨酸氨基酸残基磷酸化的激酶,参与许多细胞调节过程,并在多个不同的信号通路中有助于缓解炎症。而使用GSK-3β抑制剂作用于特定信号通路可抑制RA的炎症反应,表明抑制GSK-3β可以有效治疗RA,为治疗RA提供了新的方向,但其安全性还需要大量的临床研究进一步评估。GSK-3β在RA中研究较充分的是其抗炎作用,而GSK-3β对其他风湿病的具体作用机制研究较少,还需进一步研究,以期为风湿病的治疗提供更多的理论依据。