足细胞自噬机制和靶向信号通路相关研究进展*

陈 立,柳敏娜,赵欣怡,席春生△

(1.中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院肾脏内科,兰州 730000;2.甘肃中医药大学第一临床学院,兰州 730000)

足细胞排列在毛细血管环的外侧,通过错综复杂的足突网络连接到肾小球基底膜。典型成熟足细胞可分为细胞体、主要突起、足突3个部分。足细胞的足突由裂孔隔膜细胞连接,在形成包裹肾小球交错毛细血管网络中发挥作用。每个裂孔隔膜的细胞一侧都有一个电子密度高且富含蛋白质的区室结构,这对裂孔隔膜的完整性和信号转导具有重要意义[1]。裂孔隔膜是防止蛋白丢失所建立的最后一道滤过屏障。足细胞在维持肾功能方面高度专一,并具有自噬活性以维持肾脏健康。当足细胞功能受损时,未过滤的大分子物质进入尿液,导致蛋白尿的形成。与肾小球系膜细胞和内皮细胞不同,足细胞损伤后无法有效地增殖和补充受损细胞,导致细胞数量进行性减少。自噬对足细胞、肾小管上皮细胞及健康肾脏中的免疫细胞动态平衡和生存至关重要。足细胞有丝分裂后与其他肾小球细胞相比具有更强的基础自噬。这种细胞保护性质量控制机制有助于避免细胞退化。本文就足细胞损伤及自噬的可能机制和靶向信号通路综述如下。

1 足细胞损伤

足细胞损伤是指足突肥大、扁平及消失。与肾小球的其他常驻细胞、系膜细胞和内皮细胞不同,足细胞不能进行适当的有丝分裂过程,足细胞缺乏后无法有效地增殖和补充受损细胞,导致足细胞数量进行性减少,对肾脏产生不可逆转的损伤。足细胞是高度分化的终末细胞,更新能力有限,依赖于调节和组织肌动蛋白细胞骨架、细胞外基质来维持其复杂结构。这对足细胞施加了巨大的能量需求,使足细胞需要维持足够的线粒体数量及适当的功能[2]。足细胞通过肌动蛋白细胞骨架以大量的腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)来维持足突表面积,而线粒体DNA和蛋白质的突变可能导致ATP丢失、滤过屏障的破坏等[3]。研究指出,足细胞和血管内皮细胞具有额外的线粒体功能,能控制脂肪酸代谢[4]。肾脏依靠线粒体脂肪酸代谢产生能量,一旦出现能量代谢障碍可引起肾脏足细胞、肾小管损伤。

2 足细胞自噬

自噬是一种保护机制[5]。其通过膜包裹部分细胞质和细胞中需要降解的细胞器、蛋白质来形成自噬体,自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体,降解损伤蛋白质内容物,实现细胞内动态平衡。自噬的保护作用可以概括为提供能量来维持稳态,通过消除细胞中有缺陷的大分子和细胞器来修复细胞,在细胞的生存和维持中发挥着重要作用。因此,自噬的功能障碍导致了许多人类疾病的发生。

足细胞自噬是一种维持细胞内动态平衡的降解系统,作为一种高分化细胞在基础水平下表现出高度自噬活性[6],也可作为慢性肾脏疾病的治疗靶点[7]。足细胞的基础自噬水平高于其他类型的肾小球细胞,是一种细胞保护的质量控制机制。自噬对肾细胞(如足细胞和肾小管上皮细胞)及健康肾脏中免疫细胞的动态平衡和生存至关重要。作为有丝分裂细胞,足细胞无法将潜在危险的细胞成分稀释到其子代细胞中。为消除这些成分,足细胞需要较高的基线自噬水平。自噬的激活与足细胞损伤呈负相关,足细胞损伤是肾小球疾病蛋白尿进展的原因。对小鼠的研究表明,足细胞表现出有大量自噬小体及高水平自噬。足细胞特异性Atg5基因的缺失导致衰老小鼠的肾小球病变,其氧化、泛素化蛋白的积累及足细胞内质网应激最终导致足细胞损伤、蛋白尿增加和肾小球硬化[8-9]。

在肾脏中,需要生理水平的雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)和腺苷5’-单磷酸活化蛋白激酶(adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase, AMPK)活性来支持肾细胞的生长和分化,并维持肾脏细胞完整性和正常肾单位功能,包括电解质、水和葡萄糖的转运。足细胞自噬的调控机制复杂,其上游信号通路主要涉及mTOR依赖途径和mTOR非依赖途径。mTOR和AMPK在控制细胞生长、增殖、分化、代谢和存活方面具有关键作用,有助于肾脏在内的各种器官的生理发育和功能[10]。mTOR可形成两种功能性多蛋白激酶复合物,mTOR复合体1(mTOR complex 1,mTORC1)和mTORC2[11-12]。mTORC1的过度激活导致足细胞和肾小管细胞功能障碍和易受损伤,从而促进慢性肾脏疾病的发展。靶向调控mTOR或AMPK途径,可能是控制或预防这些疾病的有效治疗方法(图1)。

PLA2R:磷脂酶A2受体;SPAG5:精子相关抗原5;CFTR:囊性纤维化跨膜传导调节因子;SGLT-2:钠-葡萄糖协同转运蛋白2;TSC:结节性硬化症复合体;NF-κB:核因子-κB;NLRP3:含NLR家族Pyrin域蛋白3;MAPK:丝裂原活化蛋白激酶;SPLA2-IB:分泌型磷脂酶A2 IB; TNT:隧道纳米管;2DG:2-脱氧-D-葡萄糖。

3 足细胞自噬相关潜在信号通路

3.1 mTOR

mTOR信号通路的靶标在调节细胞生长、增殖、存活和代谢方面起着关键作用。mTOR信号失调与许多疾病有关,包括糖尿病、神经退行性疾病和癌症。mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,形成两个较大多蛋白复合体的催化亚单位,即mTORC1和mTORC2。这两种酶在自噬过程中发挥不同作用。mTOR信号传导是通过控制UNC-51样激酶1(UNC51-like kinase 1,ULK1)复合物和球形孢子丝菌液泡分选蛋白34(vacuolar protein sorting 34,VPS34)复合物的活性、TFEB/TFE3的细胞内分布和原溶酶体小管重建来调节自噬过程的多个方面[13]。研究人员用果蝇肾脏细胞建立足细胞模型,发现阻止mTOR信号传导可致裂隙隔膜间距增加[14]。mTOR途径激活的自噬保护足细胞免受细胞凋亡、足突消失和慢性肾脏疾病进展的影响。

在健康状态下,肾小球足细胞通过维持低水平的mTOR基础活性和高水平的基础自噬活动来促进细胞更新,清除受损的细胞器、多余的脂类、长寿或错误折叠的蛋白质[15]。mTORC1活性可在体内诱导足细胞自噬,但长期雷帕霉素治疗对足细胞mTORC1的基因抑制并不能实质上诱导自噬。在糖尿病肾病的早期阶段,适当激活mTOR可保护足细胞免受损伤,并参与蛋白质合成和足细胞修复过程[16]。研究人员发现,抑制PLA2R后可激活足细胞中的PI3K/Akt/mTOR通路,有助于保护足细胞免受凋亡的影响,并为mTOR用于治疗膜性肾病提供细胞学证据[17]。XU等[18]研究表明,SPAG5在膀胱尿路上皮癌中激活了Akt/mTOR信号通路,提示SPAG5可能调节自噬并在足细胞损伤中发挥作用。在高糖处理下,SPAG5 mRNA和蛋白表达水平均上调。沉默SPAG5可逆转高糖处理的足细胞凋亡增加和自噬减少现象。ZHOU等[19]指出,自噬抑制剂加重了足细胞的损伤,表明足细胞自噬是狼疮肾炎保护的靶点。此外,研究表明,mTORC1抑制剂、mTOR类似物可以在啮齿动物模型中预防或延缓肾脏疾病的发生、发展[20]。

3.2 AMPK

AMPK是能量代谢的重要调节因子,由一个催化α亚基、β亚基和γ亚基组成的异源三聚体蛋白构成[10]。AMPK活化后可直接启动自噬体磷酸化形成的关键分子ULK1并促进自噬,作用于多个下游靶点,通过抑制合成代谢过程和增加分解代谢过程来增加ATP的生成和减少消耗。mTOR抑制剂(如雷帕霉素类似物)和AMPK激活剂(如二甲双胍)可特异性敲除动物模型和细胞培养物中的细胞作用,有较高的临床价值。AMPK通过磷酸化ULK1刺激自噬。相反,mTORC1通过阻止ULK1的激活和扰乱AMPK与ULK1之间的相互作用来抑制自噬[21]。

二甲双胍是一种口服治疗糖尿病药物,研究发现通过在小鼠模型中激活AMPK和抑制mTOR可改善细胞自噬,保护足细胞,减少蛋白尿,增加高血压大鼠足细胞中血管内皮生长因子的产生,重建糖尿病大鼠肾脏中足细胞或肾上腺素的表达[22]。此外,二甲双胍抑制CFTR介导和mTOR参与靶标。研究发现,SGLT-2抑制剂通过作用于TSC或氨基酸敏感机制来抑制mTORC1的活性,这种机制将导致mTORC1活性的特异性部分抑制,同时伴随着AMPK的激活[23-24]。

山奈酚(kaempferol,KPF)具有促进自噬和抑制细胞凋亡的特性,通过增加AMPK和降低mTOR表达来调控AMPK/mTOR信号通路,减轻糖尿病蛋白尿和糖脂代谢功能障碍,缓解肾小球基底膜增厚及足细胞的丢失或融合[25]。Sestrin2是多种信号通路的上游信号分子,具有增强细胞自噬、减弱内质网应激、强化氧化防御调节细胞稳态的作用。在糖尿病动物模型中Sestrin2高表达,不仅会阻碍糖尿病肾上皮-间充质转化和细胞外基质积累,还能增强AMPK、Nrf2信号传导及抑制mTORC1表达,改善足细胞损伤、系膜增生、蛋白尿和肾纤维化,延缓糖尿病肾病发展[26]。

3.3 sirtuins(SIRT)

SIRT是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性脱乙酰酶,包括SIRT1～7。SIRT活性与DNA修复、细胞凋亡、细胞存活和发育、炎症和健康衰老有关[27]。SIRT对足细胞损伤相关的肾小球疾病有多效性保护作用,如改善免疫炎症状态和氧化应激水平、维持线粒体稳态、增强自噬和调节脂质代谢[28]。激活SIRT对不同足细胞损伤相关的肾小球疾病具有保护作用,包括糖尿病肾病、局灶节段性肾小球硬化症、膜性肾病、免疫球蛋白A(IgA)肾病和狼疮性肾炎。研究表明,这些效应与SIRT1的蛋白质量和活性降低、AMPK磷酸化降低相关[29-30]。

LIU等[31]发现,在两个独立的小鼠模型中,SIRT6通过对Notch信号的表观遗传调节来保护足细胞。SIRT6在足细胞中具有多效性保护作用,包括抗炎和抗凋亡作用,并参与肌动蛋白细胞骨架维持和自噬促进。其中,SIRT6通过去乙酰化组蛋白H3K9促进Notch1和Notch4的转录。研究报道,叉头框蛋白M1(forkhead box M1,FOXM1)对急性肾损伤具有保护作用,改善了小鼠的肾功能,增加了肾组织中足细胞标志物肾病蛋白的表达[32]。FOXM1与SIRT4的启动子结合可以诱导转录激活,反之,下调SIRT4可阻断FOXM1在体内和体外的保护作用。FOXM1转录激活SIRT4并抑制NF-κB信号传导和NLRP3炎症小体,以减轻糖尿病肾病的肾损伤和足细胞损伤。这些发现均表明SIRT是预防足细胞损伤潜在治疗靶点之一。

3.4 MAPK

MAPK信号通路是真核细胞功能的高度保守调节剂[33],调节细胞周期、细胞凋亡、分化、蛋白质生物合成和肿瘤发生等多个生物过程。激酶使MAPK磷酸化,启动和控制激活幅度。相反,MAPK磷酸酶使MAPK去磷酸化,下调和控制信号的持续时间。

研究发现,特发性膜性肾病患者的SPLA2-IB和M型磷脂酶A2受体水平明显高于非肾病蛋白尿者,自噬小体明显少于非肾病蛋白尿者[34]。在体外,SPLA2-IB诱导足细胞自噬不足,并通过激活p38 mTOR/ULK1ser757信号通路促进足细胞损伤。抑制p38 MAPK明显抑制了SPLA2-IB诱导的自噬和mTOR/ULK1ser757的激活。用siRNA干扰PLA2R的表达明显减弱了SPLA2-IB对足细胞自噬的影响。SPLA2-IB通过激活p38 MAPK/mTOR/ULK1ser757信号通路下调特发性膜性肾病足细胞自噬。MAPK通路可以诱导细胞在不同类型的细胞中自噬[35],自噬在防御脂多糖诱导的足细胞损伤中发挥了积极的作用,证明lncRNA牛磺酸上调基因1(lncRNA taurine-upregulated gene 1,TUG1)通过激活MAPK通路靶向miR-197对内毒素诱导的足细胞损伤具有保护作用。

3.5 肌动蛋白细胞骨架通路

在足细胞中,自噬是一种自稳机制,有助于肌动蛋白细胞骨架形态和功能完整性的形成和保持。足细胞损伤以细胞骨架重塑和足突融合为特征。在体内,鸟氨酸脱羧酶抑制剂即二氟甲基鸟氨酸(difluoromethylornithine,DFMO)可减少小鼠的尿白蛋白排泄,减轻足细胞足突融合。2-DG诱导足细胞mTOR信号激活和细胞骨架重塑,鸟氨酸脱羧酶基因敲除可减轻这一作用。从机制上,鸟氨酸分解代谢的代谢产物腐胺可以激活GTP酶Ras同系物,后者为mTOR信号的感受器,表明糖尿病条件下足细胞糖酵解受损可增强鸟氨酸分解代谢,鸟氨酸分解代谢产物激活mTOR信号,促进糖尿病肾病足细胞骨架重构。

4 其他信号通路

新出研究表明,Breviscapine(Bre)对糖尿病大鼠具有肾保护作用[36]。在链脲佐菌素诱导糖尿病肾病的试验小鼠模型中发现Bre能大幅提高足细胞活力,改善足细胞损伤,如α-平滑肌肌动蛋白表达减少。Bre通过抑制NF-κB/NLRP3-mediated信号通路介导细胞凋亡,减轻高糖诱导的足细胞损伤并改善了糖尿病小鼠的肾功能。

TNT是一种开放式通道,可远距离连接细胞。细胞在受到刺激时,细胞间可形成TNT将细胞分组(如小细胞器)转移至受损细胞,通过替换受损的细胞器以增加受体细胞对损伤的抵抗力。细胞质蛋白肿瘤坏死因子α诱导蛋白2(tumor necrosis factor alpha induced protein 2,TNFAIP2)在TNT形成中发挥关键作用,TNT是瞬时连接细胞的膜通道,允许细胞器转移[37]。TNFAIP2过表达增强了TNT介导转移,并阻止了晚期糖基化终产物诱导的自噬、溶酶体功能障碍和细胞凋亡。TNFAIP2通过允许TNT介导的自噬体和溶酶体交换,对糖尿病肾病背景下的足细胞中起重要的保护作用,并且可能代表一种新的药物靶标。

5 小结与展望

足细胞自噬可能是预防足细胞损伤和蛋白尿的潜在治疗靶点。自噬能及时清除异常积累蛋白质、功能失调的细胞器、入侵的细菌,以维持细胞的正常生理功能。自噬在其他足细胞相关疾病(如微小病变性疾病和局灶节段性肾小球硬化)中的作用仍有待研究。SIRT在调节mTOR信号通路、AMPK、自噬激活及足细胞健康相关的各种关键通路和代谢中发挥了关键作用。为评估靶向细胞自噬是否是预防和治疗肾脏疾病的关键,还需要进行更多基础临床研究,以帮助临床开发针对足细胞自噬功能的靶向药物。