施用猪粪水对青脆李果实品质和产量、土壤中微生物群落与抗生素耐药基因的影响

雷云峰,何志平,龚建军,肖 璐,涂 腾,曾 凯,付 敏,曾祥忠

(1.四川省畜牧科学研究院,成都 610066;2.四川省农业科学院农业资源与环境研究所,成都 610066)

【研究意义】中国是世界生猪生产和消费第一大国,为稳定生猪生产,保障猪肉持续供给,满足社会对肉类的需求,国家出台了一系列政策和措施支持生猪产业发展。然而粪污处理已成为制约生猪生产的瓶劲,“以种定养、以养肥田”是我国当前的粪污资源化利用的主要原则,国家层面已将粪污还田作为养殖废弃物资源化利用的主要途径。农业农村部还开展了绿色种养循环农业试点工作,全国农技中心印发了《2022年主要农作物沼液施用技术指导意见》,对不同农区的农作物提出了推荐使用量和施用方法。由此可见,畜禽粪污资源化利用是畜禽养殖业污染防治最为经济有效的途径,也是治本之策。【前人研究进展】将畜禽粪污施入农田在我国具有悠久历史,畜禽粪污本是土壤所需的优质有机肥料,随着我国畜禽养殖业的快速发展,畜禽粪污未经科学处理和利用,已成为我国农村最重要的污染源之一[1-2],未经处理的畜禽粪污不仅会污染空气、水源、环境,还可传播病原[3-4],且畜禽粪便中含有大量的氮磷化合物或添加剂中的重金属物质,会破坏土壤的正常功能,削弱土壤净化能力,最终导致土壤孔隙堵塞和板结,此外,粪污中还可能残留抗生素或抗生素耐药基因[5-6],造成水体、沉积物、土壤等环境介质中的耐药基因富集[7],带来严重的食品质量安全和公共卫生安全风险,对环境污染、生态平衡、人与动物健康造成了巨大的威胁。经科学处理和利用的畜禽粪尿既可为作物等提供肥料,又可提高土壤中的有机质含量和改善土壤质量,研究表明,长期施用沼液后土壤有机质含量、全氮、碱解氮、有效磷、速效钾等有不同程度的升高,土壤培肥效果显著[8]。李子树,原产于我国,有3000余年的栽培历史,青脆李在四川的栽培历史悠久,分布范围广,是四川省主栽地方品种李[9],据统计资料,2021年全国李子树栽种面积达1.95×106hm2。相对于化肥成本的不断上升,将处理后的畜禽粪便还田,既能为土壤改良提供营养物质来源,又能降低种植成本,还可提高土壤生产力、促进生态农业的可持续发展、助力乡村振兴[10-13]。【本研究切入点】目前,对猪粪农田利用的研究主要集中于猪粪或其堆肥产物用量、与其他物料配合施用以及对作物生长、培肥土壤、替代化肥和影响农田环境等方面[14-16]。《畜禽粪污土地承载力测算技术指南》(NY-T 3877—2021)、《农区耕地畜禽承载力评估技术规程》(DB51-T 1493—2021)等标准中,均没有对李子树种植园的承载力提出推荐值,《2022年主要农作物沼液施用技术指导意见》中也没有推荐李子树种植园沼液的施用量,也未查阅到有关在李子树施用猪粪水的相关研究。【拟解决的关键问题】本研究选择青脆李作试验材料,基于田间小区试验,以不同比例猪粪水替代化肥对李树进行施肥处理,比较不同猪粪水施用组对李树果实品质、产量,李树种植土壤性质、土壤中微生物群落变化和抗生素耐药基因变化的差异。通过比较不同猪粪水施用比例对李树果实品质、产量,李树种植土壤性质、土壤中微生物群落变化和抗生素耐药基因的影响,评估猪粪水替代化肥作为青脆李树肥料的可行性,为全国1.95×106hm2李子树基地科学施用贮存腐熟后的猪粪水提供指导。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

本试验地在四川省资阳市乐至县高寺镇某青脆李种植基地内。该李子园地处中纬度季风区,属亚热带季风气候,日均气温16.7 ℃,年均日照1330 h,年均降水量900 mm。供试土壤类型为石灰性紫色土。

1.2 试验材料

猪粪水来源于四川省资阳市乐至县高寺镇某猪场,并按照《畜禽粪便无害化处理技术规范》(GB/T 36195—2018)中要求,在氧化塘贮存,经3～5个月腐熟的水泡粪原液,供试原液的平均理化性质为pH 7.67、有机质23%、总氮865 mg/L、总磷107 mg/L、总钾896 mg/L;化肥选择复合肥(24-8-13);供试果树为长势基本一致的5年生青脆李,试验地灌溉条件良好。

1.3 试验主要仪器与试剂

核酸蛋白仪(型号为Nanodrop 2000)、Qubit荧光计(型号为Qubit 2.0 Fluorometer)均购自赛默飞世尔科技有限公司;测序仪(型号为Hiseq 4000)购自因美纳公司;生物分析仪(型号为Agilent 2100 Bioanalyzer)购自安捷伦科技(中国)有限公司;凝胶电泳仪(型号为Power Pac 300)、全自动紫外凝胶成像系统(型号为Chemi Doc XRS+)均购自伯乐公司。土壤基因组提取试剂盒、Qubit定量试剂盒购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司;琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 试验分组及施肥 试验设置5个处理,每个小区5株李树,李树行距4 m、株距3 m,重复3次。试验在施用等氮量的基础上调节猪粪水与化肥的比例,处理如下:F100为100%化肥对照(100%F);PS25为25%猪粪水替代化肥(25%PS+75%F),折算每次猪粪水施用量1.375 m3/667 m2;PS50为猪粪水替代50%化肥(50%PS+50%F),折算每次猪粪水施用量2.750 m3/667 m2;PS75为猪粪水替代75%化肥(75%PS+25%F),折算每次猪粪水施用量4.125 m3/667 m2;PS100为猪粪水替代100%化肥(100%PS),折算每次猪粪水施用量5.500 m3/667 m2。将猪粪水或化肥按照比例在水池中搅拌均匀后抽入粪桶,以浇灌的方式进行施用,一年施肥3次。

1.4.2 青脆李果实品质及产量测定及分析 青脆李果实成熟后,将每个小区的5株果树上果实全部采摘称重,并从中随机选取60颗果实,测定果实品质。使用电子天平测定果实单果重,使用游标卡尺测定果实横径,用水分分析仪测定果实水分,利用手持折光仪测定可溶性固形物含量,采用中和滴定法测定有机酸含量,采用蒽酮比色法测定可溶性糖含量。数据处理采用Excel 2019和SPSS 23.0软件进行数据统计分析,采用Duncan法对试验数据进行方差分析和显著性检验。

1.4.3 土壤样品采集 青脆李收获后,在每个小区树冠滴水线外围10 cm东西南北4个方向,随机用土钻取4穴土壤,每穴土壤钻取深度10 cm,将4穴土壤混匀后制成1个混合土样。每个混合土样用四分法分成2份备用。将各个处理不同小区采集土样单独送检,分别命名为:F100A/B/C、PS75A/B/C、PS50A/B/C、PS25A/B/C、PS100A/B/C。

1.4.4 理化和生物学性质测定 将每小区采回的混合土样品风干后测定其理化性质,土壤pH测定采用酸度计电位法;全氮(TN)含量测定采用用凯式定氮法;土壤有机质(SOM)含量测定采用重铬酸稀释热法,碱解氮(AN)含量测定采用碱解扩散法,速效磷(OP)含量测定采用0.5 mol/L NaHCO3浸提-钼锑抗比色法,速效钾(TK)含量测定采用醋酸铵-火焰光度法,土壤重金属全量(THM)含量测定采用HCl-HNO3-HClO4消煮,重金属有效态测定采用0.1 mol/L HCl溶液浸提,Cu、Zn含量测定采用原子吸收分光光度计。

1.5 土壤中菌群及耐药特性的宏基因组分析

1.5.1 土壤样品中DNA的提取 将每小区采集的土壤样品放置于干冰泡沫箱带回实验室,采用土壤基因组提取试剂盒,提取样品DNA,采用Nanodrop核酸蛋白仪确保DNA的浓度及纯度符合要求(OD260/OD280比值介于1.8～2.0)。

1.5.2 DNA文库的构建及检测 依托北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行建库和测序工作。取测定合格的DNA样品,采用超声破碎仪随机将DNA片段化为约350 bp的长度,再进行末端修复、加A尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成文库的制备。使用Qubit2.0初步定量构建的文库,稀释为2 ng/μL,采用Agilent 2100检测文库的insert size,当insert size符合预期后,使用荧光定量PCR对文库的有效浓度进行定量,保证文库的有效浓度大于3 nmol/L,确保文库质量。

1.5.3 上机测序及数据的统计分析 待库检合格后,把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求混池后进行Illumina HiSeq 4000测序,测序策略为PE150 bp,统计原始数据(Raw data)和有效数据(Clean data),并对数据质量进行分析。提取数据,获得原始数据,再进行数据过滤及质控,去除含接头和低质量的读长(reads),包括:N碱基达到一定比例(设置为10 bp)、长度小于40 bp、质量值低于38、与接头(adapter)之间重叠(overlap)超过一定阈值(设置为15 bp),再导入猪的基因组数据库进行比对,过滤掉来自宿主猪的DNA污染,最终获得过滤后的有效数据,后续分析均基于此数据。利用SOAP denovo对有效数据进行组装分析,将用于组装的参数k-mer值设为55,对单个样品进行组装,将得到的单样品长序列片段(saffolds)从N连接处打断,得到不含N的序列片段(scaftigs)。保留大于500 bp的序列片段,采用MetaGene Mark进行开放阅读框(ORF)预测,得到的ORFs与NCBI中NR数据库抽提出的细菌、真菌、古菌和病毒进行序列比对,参数设置期望值e-value≤1e-5,分析获得物种注释信息及丰度[17-19]。使用CARD数据库提供的Resistance Gene Identifier (RGI)软件,采用Lowest common ancestor(LCA)算法进行ARO的注释和丰度分析。

2 结果与分析

2.1 不同处理对青脆李果实品质的影响

由表1可知,从单果重来看,PS75处理单果重量最大,为(41.45±0.78) g,与PS50、PS25处理之间差异不显著(P>0.05,下同),而显著高于F100处理(P<0.05,下同),与PS100存在极显著差异(P<0.01);就单果横径和单果体积来看,5个处理之间均不存在显著差异。对不同施肥处理果实品质进行分析可知(表2),PS75处理果实水分含量最高,但与其它3个处理(PS25、PS50、PS100)的水分含量不存在显著性差异,而PS25、PS75处理均显著高于F100处理;维生素C含量最高为PS50处理,可溶性固形物含量和可溶性总糖最含量高的均为F100处理,但5个不同处理间不存在显著差异。可见,施用猪粪水不会降低青脆李果品的品质,PS75和PS50处理可以提高青脆李果实外观品质。

表1 不同处理对青脆李果实外观的影响

表2 不同处理对青脆李果实品质的影响

2.2 不同处理对青脆李产量的影响

由图1可知,就不同施肥处理青脆李产量结果来看,PS50处理的产量最高,达到(678.55±7.83) kg,与PS75、PS100处理不存在显著差异(P>0.05),而显著高于F100和PS25处理的产量(P<0.05)。可见PS50处理可以增加青脆李产量。

图1 不同施肥处理对青脆李产量的影响Fig.1 Effects of different fertilization treatments on yield of green crisp plum

2.3 不同处理对土壤理化性质的影响

土壤pH直接影响植株对营养物质的吸收,对于养分供应及作物发育有重要意义[20-21]。土壤中有机质包括土壤中各种形态的含碳化合物,影响土壤生产力、保肥及缓冲性能,是评价土壤肥力的重要指标[22]。由表3可知,各处理间的pH变化幅度较小,土壤均呈碱性,pH 8.46～8.61,较试验开始土壤pH(7.55)有明显升高;各处理间F100处理的pH极显著高于PS100处理(P<0.01)。各处理中全氮含量的变化幅度也较小,在0.08～0.09,而有机质、碱解氮、有效磷、速效钾、总砷、全铜、全锌含量均不存在显著性差异(P>0.05)。可见,不同处理对青脆李生长环境中土壤的基本理化指标影响不明显,未形成显著的改善或影响。

表3 不同处理对土壤理化性质的影响

2.4 土壤宏基因组测序结果

2.4.1 原始及有效序列统计 基于Illumina PE150测序策略对15份土壤样本进行宏基因组测序,共获得189 721.46 Mb的原始数据,过滤和质控后得到189 499.98 Mb的有效数据,总有效率达99.81%,15个小区样品的详细信息见表4。

表4 15个样品宏基因组原始及有效数据统计

2.4.2 不同处理组样品的菌群结构 将15份土壤样品测序、原始去冗后的预测基因在NCBI NR数据库中进行注释,共注释4个界、198个门、192个纲、373个目、878个科、3800个属、25 266个种。在门水平上的菌群结构见图2,假单胞菌门(Pseudomonadota)、放线菌门(Actinomycetota)、酸杆菌门(Acidobacteria)、Chloroflexota门、芽单胞菌门(Gemmatimonadota)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、Candidatus Rokubacteria门、亚硝化球菌门(Nitrososphaerota)、浮霉菌门(Planctomycetota)、硝化菌门(Nitrospirota)是优势菌群。5个处理样品的优势菌群存在一定差异,从门水平上分析,PS100处理样品中占比最高的为放线菌门,占比24.03%,而F100、PS75、PS50、PS25处理样品中占比最高均为假单胞菌门,占比分别为18.89%、20.56%、23.59%、20.66%;从纲水平上分析,PS100处理样品中占比最高的为放线菌纲,占比9.49%,而F100、PS75、PS50、PS25处理样品中占比最高均为甲型变形菌纲(Alphaproteobacteria),占比分别为7.90%、8.48%、12.26%、8.57%。可见,土壤样品中的优势菌群在门分类级别上呈现出一定的差异,其中PS100处理菌群与其他处理存在明显的差异。说明,不同施肥处理方式会引起果树种植土壤菌群的组成差异。

图2 不同处理土壤细菌门水平相对丰度Fig.2 Relative abundance of bacterial phylum in soil under different treatments

2.4.3 不同处理中ARO的耐药特性分析 通过对5个试验小区的15份土壤样品中各耐药类型ARO数量分析发现,样品中检出的ARO丰富多样,15个土壤样品中共检出39种ARO,其中不同施肥处理F100、PS25、PS50、PS75、PS100检出的ARO种类数量分别为20、27、33、34、35种。本次检出的39种ARO涉及糖肽类、四环素类、磷霉素类、磺胺类、外排泵类、氨基糖苷类、利福霉素类7类常见抗生素耐药类型及其他耐药类型(表5),其中,糖肽类ARO检出种类最多,共检出16种,占总检出数的41.03%,包括vanY、vanX和vanW的变体;四环素类7种,均为tet系列ARO,占总检出数的17.95%;磷霉素类和外排泵类均4种,磺胺类和氨基糖苷类各2种,利福霉素类1种,其他类ARO主要包括otrA、rpsL、rsmA。

表5 土壤中ARO类别

由表6可知,本研究检出的39种ARO共对应5种抗生素耐药机制类型,包括:抗生素外排泵(Antibiotic efflux)、抗生素失活(Antibiotic inactivation)、抗生素靶点保护(Antibiotic target protection)、抗生素靶点结构改变(Antibiotic target alteration)、抗生素靶点替代(Antibiotic target replacement),其中抗生素靶点保护占比最高,达46.2%(18/39),其次分别为抗生素外排泵,达20.5%(8/39);抗生素失活,达17.9%(7/39);抗生素靶点结构改变,达12.8%(5/39),仅磺胺类的dfrA16对应抗生素靶点替代。从不同施肥处理检出ARO分析可知,F100、PS25、PS50、PS75、PS100处理分别检出25、26、34、35、35种ARO,所有样品中均检出的ARO有23种,包括糖肽类11种ARO(vanYM、vanYG、vanYF、vanYB、vanYA、vanWI、vanWG、vanWB、vanTG、vanHO和vanG),磷霉素类4种ARO(FosXCC、FosI、FosA8和murA),四环素类2种ARO(tetM、tetW/N/W),外排泵类3种ARO(qacJ、qacG、adeF),利福霉素类helR以及其他类的otrA、rpsL。而磺胺类的dfrA16及铜绿假单胞菌毒力的基因rsmA在含猪粪便的PS100、PS75、PS50及PS25施肥处理中均有检出,而在F100全化肥施肥处理中未检出。

由图3可知,PS100处理ARO的相对丰度和最高,达到212.72～223.44 ppm,而PS75、PS50和PS25处理的ARO相对丰度和值波动幅度较小,在132.21～159.94 ppm,而F100处理的ARO相对丰度较添加猪粪的4个处理相对偏低,在101.19～126.64 ppm。此外,本研究采集样品中ARO种类达39种,但大部分ARO的相对丰度并不高,糖肽类ARO的相对丰度占各样品相对丰度总和的85.79%～95.37%,故糖肽类ARO是采集各施肥处理组土壤中的主要ARO。将PS50和PS25处理相比,两处理的ARO种类分别为34、26种,ARO相对丰度和分别为132.21～159.94、141.45～161.21 ppm,对应的耐药机制均为5种,故PS50处理的ARO相对丰度和稍低于PS25处理,而PS50处理的ARO种类又高于PS25处理;将PS50和PS75处理相比,ARO种类分别为34、35种,ARO相对丰度和值分别为132.21～159.94、146.92～157.40 ppm,对应的耐药机制也均为5种,PS50处理的ARO相对丰度和低于PS75处理,且PS50处理的ARO种类低于PS70处理。因此,从ARO种类、丰度和耐药机制的角度考虑,PS50和PS25处理均可作为施肥备选方式。可见,不同处理对青脆李生长环境中土壤中的ARO具有一定的影响,猪粪水的施用量与环境土壤中ARO的种类与相对丰度存在一定的正相关关系,PS50和PS25处理是替代化肥比较适宜的方式。

图3 不同施肥处理组中土壤ARO的相对丰度Fig.3 Relative abundance of soil ARO in different fertilization groups

3 讨 论

3.1 不同处理对青脆李果实品质的影响

科学施肥是实现丰产优质的基础,施肥与果皮的外观品质具有密切联系,肥料种类和施肥量等均可影响果实品质[23-24]。影响青脆李果实外观和品质的重要指标包括果实大小、水分含量、维生素C、可溶性固形物及可溶性糖等。李雪玲等[25]研究农家肥、缓释肥及菌渣对安哥诺李李园的施肥效果,结果发现农家肥可极显著提高安哥诺李果实中锌、镁和可溶性固形物的含量,提高25.63%～82.61%。张志林等[26]发现有机肥替代化肥能显著提高三华李果实品质,在增加果实维生素C和可溶性固形物含量的同时,有效降低可滴定酸含量,50%无机肥N+50%有机肥N处理的效果更好。在本研究中,通过对李树果实单果重、单果横径、单果体积等外观指标,李树产量、水分、维生素C、可溶性固形物、可溶性总糖等果实品质指标测定,发现不同比例猪粪水施肥处理之间青脆李果实品质和产量的变化存在一定差异,其中PS75、PS50施肥组青脆李果实外观品质均较优,且PS50施肥组的维生素C含量最高。可见,施用猪粪水替代部分化肥,能满足青脆李生长发育对氮磷钾三大元素及其他微量元素的需求,促进植株对养分的吸收,且不会降低青脆李果品的品质。

3.2 不同处理对青脆李产量的影响

作物的优质高产与生产过程中的水肥管理密不可分,若一味追求产量,大量施用化肥,而忽视有机肥的投入,可能导致农田耕作层土壤团粒结构破坏、减少,从而直接影响作物的生产能力[27]。郑明强[28]通过对有机肥不同施用量对脆红李产量及经济效益的影响,发现750 kg/hm2无机复合肥投入的前提下,配施12.0 t/hm2商品有机肥施用效果最佳,单产可达31 549.05 kg/hm2。张志林等[26]发现,以有机肥替代化肥可以显著提高三华李果园土壤养分、果实产量和品质,其中,50%无机肥N+50%有机肥N处理的效果更佳,产量达57 497.55 kg/hm2。在本研究中,也是PS50处理组青脆李的产量最高,这可能是因为有机肥含有丰富的营养元素,施入土壤后可持续提供李生长发育所需的各种养分和活性物。

3.3 不同处理对土壤理化性质的影响

土壤的物理和化学特性是评价土壤质量的基本指标[29],土壤中所储存的氮、磷、钾、钙、镁等矿质元素是植物生长发育的重要养分来源,但盲目、过量施用化肥可能导致土壤出现酸化、板结、养分流失等问题[30-31]。赵跃等[32]研究表明,施用不同量的有机肥均可以提高土壤中有机质、碱解氮、速效磷和速效钾含量。但本研究中,各处理中青脆李生长环境下土壤基本理化指标变化幅度较小,其中,pH和全氮含量在各组间虽存在一定差异,但整体差异较小,而有机质、碱解氮、有效磷、速效钾、总砷、全铜、全锌等指标均不存在显著性差异,可见,与施用化肥相比,施用猪粪水对青脆李生长环境下土壤中有机质含量、氮、磷、钾等营养物质的积累和土壤养分等影响不明显,究其原因可能与肥料特性有关,化肥能迅速提高土壤速效养分含量但容易淋溶,而有机肥中的养分需经过一定时间的降解才能充分释放。

3.4 土壤宏基因组测序结果分析

抗生素、动物源性细菌及其耐药基因在堆肥处理后仍可能有部分残留,并在土壤中逐渐迁移或扩散到较深的土壤层和地下水中,这种转移过程不仅会改变土壤微生物的群落结构,同时还直接影响土壤活性[33]。土壤宏基因组测序分析结果显示,猪粪水浇灌会引起果树周围土壤菌群的组成差异,改变土壤中的优势菌群,PS100处理组占比最高的为放线菌门,而F100、PS75、PS50、PS25处理组样品中占比最高均为假单胞菌门,但猪粪水的施加并不会显著提高微生物菌群多样性,尽管各组中优势菌群出现了变化,但菌群种类并无差异,这与郭巨先等[34]研究结果类似。本研究通过宏基因组测序分析发现,本次送检样品中共检出39种ARO,涉及7种抗生素耐药基因类别,对应5种抗生素耐药机制,随着猪粪水施用比例的增加,土壤中ARO的种类数量呈增加趋势,通过对PS75、PS50、PS25处理检出ARO种类、ARO相对丰度和值、对应的耐药机制种类等综合考虑,PS50与PS25处理均可作为施肥备选方式。此外,值得注意的是,有vanYM等11种糖肽类、FosXCC等4种磷霉素类、tetM等2种四环素类、qacJ等3种外排泵类、利福霉素类helR等23种ARO在所有采集样品中均检出,而磺胺类的dfrA16及铜绿假单胞菌毒力的基因rsmA在含猪粪便的施肥处理中均有检出,尤其是murA及helR这2种结核病相关ARO在所有样品中均存在,murA为磷霉素靶位蛋白基因,是结核分枝杆菌中磷霉素特异性耐药基因,而helR是一种解旋酶样蛋白,是利福霉素的特异性ARO,利福平是治疗结核病的重要药物。但猪粪供试养殖场自2020年运行以来,除少量用过磺胺类药物,从未使用过上述其他药物,而该果园在试验前有在其他养殖场购买牛羊粪进行施用,园内除试验地外其他果树在试验期也偶有施用牛羊粪,不排除上述耐药基因来源于前期的残留或迁移。各养殖场应进一步加强抗菌药物临床应用管理,进一步规范兽医抗生素的使用,严格遵守用药和休药期要求,做到合理用药、规范用药、科学用药。

4 结 论

用腐熟后的猪粪水替代部分化肥,在李子树基地施用是可行的。综合青脆李品质、产量、土壤质量、细菌耐药基因特性等因素,采用PS50处理方式(50%猪粪+50%化肥)作为青脆李施肥处理的最佳方式:每次施用2.750 m2/667 m2,每年施3次,分别在萌芽、壮果、冬前施用。在实际生产中商品化肥与腐熟后猪粪水有机肥的合理搭配施用对青脆李和生猪的生产都具有重要意义,可一定程度上提升李子的产量和品质,同时有效消纳腐熟后猪粪水,实现双赢。