LncRNA GNAS-AS1通过调节miR-449a/Notch1轴参与胃癌细胞的增殖和迁移

2024-03-13徐俐胡珊珊赵海明

实用医学杂志 2024年4期

徐俐胡珊珊赵海明

四川省医学科学院·四川省人民医院（电子科技大学附属医院）消化内科（成都 610000）

胃癌（gastric cancer，GC）致死率较高，在全球因癌死亡主要原因中排第2位，其中约有40%的GC患者在中国，严重威胁人们的身体健康和生存质量［1-2］。由于早期GC几乎没有任何症状，约70%以上的患者在诊断时病程已进入晚期，这给后续治疗造成了巨大挑战［3］。GC的发病机制复杂，涉及因素较多，因此，探索GC的病理机制和新的治疗靶点对提高治疗效果、抑制肿瘤进展具有重要意义。长链非编码RNA（long non-coding RNA，LncRNA）是多种癌症的潜在生物标志物和治疗靶点，能参与癌细胞增殖、凋亡、血管生成等多种生物学过程［4-5］。GNAS反义RNA1（GNAS antisense RNA 1，GNASAS1）是GNAS的基因转录本之一，位于人类染色体20q13.3，研究发现GNAS-AS1能够促进乳腺癌、卵巢癌、肺癌等肿瘤的发展进程［6-7］。miR-449a在含GC在内的多种癌症中出现异常低表达，且具有治疗潜能，发挥着肿瘤抑制作用［8］。缺刻基因1（Notch1）属于跨膜受体家族Notch，Notch信号通路中蛋白的异常表达与多种癌症如非小细胞肺癌、GC的发展密切相关［9］。但GNAS-AS1与GC中miR-449a/Notch1轴之间的关系仍有待进一步研究。本研究探究GNAS-AS1对GC细胞AGS增殖、迁移的影响。

1 材料与方法

1.1 一般资料收集四川省人民医院2013年9月至2017年9月30例GC患者肿瘤组织及癌旁组织标本。所有参与患者均需排除同时患有其他癌症的可能性。所获取全部人体标本均事先经患者或其委托人签署知情同意书，并获得四川省人民医院伦理委员会的批准。

1.2 细胞GC细胞株AGS购自于中国科学院上海生命科学研究院。

1.3 主要试剂与仪器胰蛋白酶、Lipofectamine 2000购自美国Thermo Fisher公司；MTT试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；Trizol试剂、RIPA裂解液购自美国Invitrogen公司；Transwell小室，美国Corning公司；Notch1、E-cadherin、Vimentin、Ncadherin、GAPDH一抗和相应二抗购自Affinity公司；si-GNAS-AS1、si-NC、miR-449a inhibitor、inhibi⁃tor NC，上海吉玛制药技术有限公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒，上海钰博生物科技有限公司。RT-qPCR仪购自美国Applied Biosystems公司；酶标仪（美国BioTek公司）。

1.4 细胞培养在37 ℃加5% CO2的湿空气中，AGS细胞在RPMI-1640中培养。培养基中添加10%胎牛血清和抗生素（青霉素100 U/mL、链霉素100 mg/mL）。

1.5 细胞分组与处理AGS细胞接种到6孔板（3 × 105个/孔），贴壁后分为si-GNAS-AS1组（转染si-GNAS-AS1）、si-NC组（转染si-NC）、si-GNASAS1+miR-449a inhibitor组（共转染si-GNAS-AS1与miR-449a inhibitor）、si-GNAS-AS1+inhibitor NC组（共转染si-GNAS-AS1与inhibitor NC）、对照组（Control组，不转染）。转染过程按照Lipofectamine 2000转染试剂盒的制造商说明进行，共转染48 h。

1.6 RT⁃qPCR测定GNAS⁃AS1、miR⁃449a和Notch1 mRNA表达用Trizol试剂从组织或培养AGS细胞中提取总RNA，程序按照提供的指南执行。然后通过逆转录试剂盒将分离的总RNA逆转录成cDNA。使用RT-qPCR仪，结合TransStart Top Green qPCR Super Mix进行PCR扩增。使用2-ΔΔCt法进行数据量化，以GAPDH为内参，分析GNAS-AS1和Notch1 mRNA表达水平；以U6为内参，分析miR-449a表达水平。RT-qPCR确切的引物序列见表1。

表1 引物设计序列Tab.1 Primers design sequence

1.7 MTT法检测细胞增殖能力取对数期AGS细胞以密度5 × 103个/孔接种在96孔板中，按1.5方法进行分组与处理。孵育48 h，弃去上层培养基，每孔加入20 μL MTT溶液，37 ℃孵育4 h。吸取上清液，每孔添加150 μL甲臜增溶溶液，于振荡器上振荡10 min，使甲臜全部溶解。在490 nm处测定各样品吸光度（OD490）。

1.8 平板克隆形成实验测量细胞增殖将AGS细胞（1 × 103/孔）接种于6孔板，培养2周，固定后用结晶紫染色。人工计数＞30个细胞形成的菌落。

1.9 wound healing法测定细胞迁移AGS细胞接种在6孔板（1 × 105个/孔）。当细胞融合约80%时，用200 μL移液枪尖端进行划痕，分别在0 h和48 h观察记录细胞迁移情况，并用Image J计算划痕愈合率。以0 h和48 h划痕宽的差值与0 h划痕宽的百分比表示划痕愈合率。

1.10 Transwell法测定细胞侵袭Transwell小室的基底膜预涂Matrigel，37 ℃过夜。将AGS细胞重悬（1 × 105个/mL），并添加到Transwell上腔，添加10%胎牛血清的RPMI-1640培养基接种于下腔。孵育1 d后，用棉签轻轻清洁上腔过滤器上表面的细胞。然后，将滤光片固定在4%多聚甲醛中，并用0.1%结晶紫染色。PBS洗涤3次后，对穿过滤光片的细胞进行成像，在显微镜下随机计数5次，计算浸润细胞的数量。

1.11 Western Blot测定蛋白Notch1、Vimentin、E⁃cadherin、N⁃cadherin表达在RIPA裂解液中冰孵育AGS细胞30 min后，细胞在4 ℃下离心15 min（10 000 ×g）。用BCA试剂盒测定蛋白浓度。然后用SDS-PAGE分离蛋白，转移到聚偏二氟乙烯膜上1 h。用5%脱脂奶粉在室温阻断1 h。加入1∶1 000稀释的Notch1、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、GAPDH一抗，在4 ℃下保存过夜。在3次洗膜后，用各自的二抗（1∶5 000）室温孵育2 h。膜用ECL试剂孵育以观察蛋白质。使用Image Lab™进行免疫印迹定量。

1.12 双荧光素酶报告基因实验TargetScan预测miR-449a与GNAS-AS1和Notch1的位点结合。通过将含有预测miR-449a结合位点的GNAS-AS1 cDNA克隆到pmirGLO双荧光素酶miRNA靶表达载体中，构建GNAS-AS1-WT荧光素酶报告载体。通过在miR-449a结合位点插入含有点突变的突变体GNAS-AS1，生成GNAS-AS1-MUT载体。同样，将野生型和突变型Notch1 3′-UTR片段克隆到pmirGLO载体中，构建Notch1-WT和Notch1-MUT荧光素酶报告载体。用Lipofectamine 2000在AGS细胞中转染miR-449a mimic或miR-NC与报告载体48 h，使用荧光测定仪测量荧光素酶活性。

1.13 统计学方法Graphpad Prism 7.0用于统计分析，计量数据以均数±标准差（）表示。采用单因素方差分析（3组及以上）、t检验（两组）确定统计学显著性，LSD-t用于单因素方差分析后的两两比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GNAS⁃AS1、miR⁃449a和Notch1 mRNA在GC组织中的表达比较肿瘤组织与癌旁组织相比，GNAS-AS1、Notch1 mRNA表达升高（P＜0.05），miR-449a表达降低（P＜0.05）。见表2。

表2 肿瘤组织与癌旁组织中GNAS-AS1、miR-449a和Notch1 mRNA的表达比较Tab.2 Comparison of GNAS-AS1，miR-449a and Notch1 mRNA expression in tumor tissues and adjacent tissues ±s，n = 30

注：与癌旁组织相比，*P＜0.05

组别癌旁组织肿瘤组织Notch1 1.00±0.00 2.17±0.24*GNAS-AS1 1.00±0.00 2.58±0.28*miR-449a 1.00±0.00 0.41±0.05*

2.2 GNAS⁃AS1、miR⁃449a和Notch1 mRNA在AGS细胞中的表达比较si-GNAS-AS1组相较于si-NC组、Control组，GNAS-AS1和Notch1 mRNA下调表达，miR-449a上调表达（P＜0.05）。si-GNASAS1+miR-449a inhibitor组相较于si-GNAS-AS1+in⁃hibitor NC组、si-GNAS-AS1组，Notch1 mRNA表达升高，miR-449a表达降低（P＜0.05），GNAS-AS1表达没有明显变化（P＞0.05）。见表3。

表3 各组AGS细胞中GNAS-AS1、miR-449a和Notch1 mRNA的表达比较Tab.3 Comparison of mRNA expression of GNAS-AS1，miR-449a and Notch1 in AGS cells of each group ±s，n = 6

注：*P＜0.05 vs.Control组；#P＜0.05 vs.si-NC组；&P＜0.05 vs.si-GNAS-AS1组；^P＜0.05 vs.si-GNAS-AS1+inhibitor NC组

组别Control组si-NC组si-GNAS-AS1组si-GNAS-AS1+inhibitor NC组si-GNAS-AS1+miR-449a inhibitor组Notch1 1.00±0.00 1.02±0.12 0.45±0.05*#0.43±0.04 0.86±0.09&^GNAS-AS1 1.00±0.00 1.01±0.12 0.36±0.04*#0.34±0.04 0.35±0.04 miR-449a 1.00±0.00 1.02±0.11 2.25±0.24*#2.23±0.24 1.62±0.18&^

2.3 各组细胞活力（OD490）的比较si-GNAS-AS1组OD490值低于Control组、si-NC组（P＜0.05）；si-GNAS-AS1+miR-449a inhibitor组OD490值高于si-GNAS-AS1组、si-GNAS-AS1+inhibitor NC组（P＜0.05）。见表4。

表4 各组细胞OD490、划痕愈合率、克隆形成数和细胞侵袭数目的比较Tab.4 Comparison of OD490，scratch healing rate，number of clone formation and number of cell invasion in each group ±s，n=6

注：*P＜0.05 vs.Control组；#P＜0.05 vs.si-NC组；&P＜0.05 vs.si-GNAS-AS1组；^P＜0.05 vs.si-GNAS-AS1+inhibitor NC组

组别Control组si-NC组si-GNAS-AS1组si-GNAS-AS1+inhibitor NC组si-GNAS-AS1+miR-449a inhibitor组细胞侵袭数目（个）157.69±8.48 159.44±10.08 93.21±8.34*#90.89±10.25 138.54±11.55&^OD490 0.70±0.08 0.68±0.07 0.29±0.03*#0.27±0.03 0.61±0.06&^克隆形成数（个）108.42±7.30 106.22±6.47 52.69±3.38*#55.38±5.02 86.79±7.08&^划痕愈合率（%）42.66±5.18 43.45±4.42 17.69±2.14*#18.32±1.97 38.85±3.56&^

2.4 各组细胞克隆形成数比较si-GNAS-AS1组的克隆形成数低于Control组、si-NC组（P＜0.05）；si-GNAS-AS1+miR-449a inhibitor组的克隆形成数高于si-GNAS-AS1组、si-GNAS-AS1+inhibitor NC组（P＜0.05）。见表4、图1。

图1 细胞克隆形成观察Fig.1 Observation of cell clonal formation

2.5 各组划痕愈合率比较si-GNAS-AS1组划痕愈合率低于si-NC组、Control组（P＜0.05）；si-GNAS-AS1+miR-449a inhibitor组划痕愈合率高于si-GNAS-AS1+inhibitor NC组、si-GNAS-AS1组（P＜0.05）。见表4和图2。

图2 wound healing实验检测AGS细胞迁移能力Fig.2 Migration ability of AGS cells was detected by wound healing experiment

2.6 各组细胞侵袭能力的比较si-GNAS-AS1组细胞侵袭数目少于si-NC组、Control组（P＜0.05）；si-GNAS-AS1+miR-449a inhibitor组的侵袭数目多于si-GNAS-AS1+inhibitor NC组、si-GNAS-AS1组（P＜0.05）。见表4和图3。

图3 Transwell实验检测AGS细胞侵袭能力Fig.3 The invasion ability of AGS cells was detected by Transwell test

2.7 各组细胞Notch1、E⁃cadherin、Vimentin、N⁃cadherin蛋白表达比较si-GNAS-AS1组与si-NC组、Control组比较，Vimentin、Notch1、N-cadherin蛋白下调表达，E-cadherin蛋白上调表达（P＜0.05）。si-GNAS-AS1+miR-449a inhibitor组与si-GNAS-AS1+inhibitor NC组、si-GNAS-AS1组比较，Notch1、Vi⁃mentin、N-cadherin蛋白表达升高，E-cadherin蛋白表达降低（P＜0.05）。见表5和图4。

图4 Western Blot检测AGS细胞Notch1、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin蛋白的表达Fig.4 Western Blot analysis of Notch1，E-cadherin，Vimentin，N-cadherin protein expression in AGS cells

表5 各组细胞Notch1、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin蛋白的表达比较Tab.5 Comparison of protein expression of Notch1，E-cadherin，Vimentin and n-cadherin in each group ±s，n = 6

注：*P＜0.05 vs.Control组；#P＜0.05 vs.si-NC组；&P＜0.05 vs.si-GNAS-AS1组；^P＜0.05 vs.si-GNAS-AS1+inhibitor NC组

组别Control组si-NC组si-GNAS-AS1组si-GNAS-AS1+inhibitor NC组si-GNAS-AS1+miR-449a inhibitor组N-cadherin 0.87±0.09 0.89±0.09 0.35±0.03*#0.33±0.03 0.76±0.08&^Notch1 0.79±0.08 0.81±0.08 0.32±0.03*#0.30±0.03 0.68±0.07&^E-cadherin 0.28±0.03 0.26±0.03 0.70±0.07*#0.72±0.07 0.42±0.04&^Vimentin 0.85±0.09 0.83±0.08 0.40±0.04*#0.42±0.04 0.75±0.07&^

2.8 GNAS⁃AS1通过miR⁃449a调控Notch1的表达图5、图6显示，miR-449a和GNAS-AS1、Notch1之间具有的结合位点。miR-449a mimic与GNASAS1-WT共转染组的荧光素酶活性低于miR-NC与GNAS-AS1-WT共转染组（P＜0.05，表6）。miR-449a mimic与Notch1-WT共转染组的荧光素酶活性低于miR-NC与Notch1-WT共转染组（P＜0.05，表7）。

图5 GNAS-AS1和miR-449a的结合位点预测Fig.5 Prediction of binding sites of GNAS-AS1 and miR-449a

图6 miR-449a和Notch1间的结合位点预测Fig.6 Prediction of binding sites between miR-449a and Notch1

表6 各组荧光素酶活性比较Tab.6 Comparison of luciferase activities in each group ±s，n = 6

注：与miR-NC与GNAS-AS1-WT共转染组相比，*P＜0.05

组别miR-NC与GNAS-AS1-WT共转染组miR-NC与GNAS-AS1-MUT共转染组miR-449a mimic与GNAS-AS1-WT共转染组miR-449a mimic与GNAS-AS1-MUT共转染组荧光素酶活性1.07±0.13 1.04±0.13 0.34±0.04*1.06±0.13

表7 荧光素酶活性比较Tab.7 Comparison of luciferase activities ±s，n = 6

注：与miR-NC与Notch1-WT共转染组相比，*P＜0.05

组别miR-NC与Notch1-WT共转染组miR-NC与Notch1-MUT共转染组miR-449a mimic与Notch1-WT共转染组miR-449a mimic与Notch1-MUT共转染组荧光素酶活性1.03±0.13 1.07±0.13 0.46±0.05*1.01±0.11

3 讨论

GNAS-AS1作为一种LncRNA，在多种肿瘤组织和细胞中呈现异常表达。马虹飞等［10］研究发现GNAS-AS1在肺鳞癌组织中高表达，且与肿瘤分期相关；GNAS-AS1能通过调节MAPK信号通路的活性影响肺鳞癌的进展，可能是肺鳞癌的治疗靶点之一。宋芷霜等［11］研究发现GNAS-AS1在卵巢癌细胞中表达升高，下调其表达可以降低卵巢癌细胞的增殖、迁移、侵袭等能力，这可能是通过负调控miR-2116-3p的表达实现的。提示GNAS-AS1是癌症治疗的可能靶点。本实验中，GC肿瘤组织中GNAS-AS1上调表达，敲低GNAS-AS1抑制了AGS细胞的迁移、侵袭和增殖能力。揭示GNAS-AS1在GC进展中发挥促癌功能。

miRNA已被众多研究证明在癌症的进展中起着重要的作用。我们通过生物信息学分析显示，miR-449a具有与GNAS-AS1相互补的序列。目前已有广泛的报道表明miR-449a在多种癌症中出现异常表达，黄洁等［12］研究发现miR-449a在肺癌细胞A549中的表达低于肺正常细胞，且miR-449a能够通过靶向HDAC1的表达，抑制肺癌的增殖、侵袭和迁移。LAN等［13］研究发现miR-449a在结直肠癌细胞中低表达，通过提高miR-449a的表达可以提高自噬能力，抑制结直肠癌细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭等。杜晨旭等［14］研究发现miR-449a在人宫颈癌细胞中呈低表达，沉默LINC01123可以通过上调miR-449a表达，抑制HGF/c-MET信号通路，进而阻碍宫颈癌细胞的转移和生长。本实验发现，沉默GNAS-AS1升高miR-449a表达。在沉默sGNAS-AS1基础上下调miR-449a表达后，细胞增殖、侵袭、迁移被抑制。提示GNASAS1敲低可能通过促进miR-449a表达阻滞AGS细胞的迁移、侵袭和增殖过程。

通过查询targetscan数据库，我们发现miR-449a潜在的靶基因包括Notch1。Notch信号通路高度保守，其在细胞分化、增殖、组织发育、稳态等过程中发挥重要的调节作用，也与癌症的发生发展密切相关［15-16］。ZHANG等［17］研究发现激活Notch信号通路可通过调节上皮间质转化通路和HES-1表达加速乳腺癌细胞迁移和增殖过程。贾晓琼等［18］研究发现miR-449a可以诱导非小细胞肺癌NCIH1975细胞凋亡和增殖抑制，其作用机制可能与抑制Notch1信号有关。本实验发现，敲低GNASAS1使Notch1下调表达，而抑制miR-449a可增高Notch1蛋白表达，提示沉默GNAS-AS1对AGS细胞迁移、侵袭、增殖的抑制作用可能与提高miR-449a来下调Notch1表达有关。

综上，我们在GC中发现了miR-449a及其直接靶点Notch1对GNAS-AS1的一种新的调控机制。GNAS-AS1的表达减少通过影响GC的增殖、侵袭和转移而阻碍GC的进展。因此，LncRNA GNASAS1可能在GC中发挥促瘤作用，提示GNAS-AS1作为GC治疗的新靶点的潜力。本研究的主要局限性是临床受试者较少，并且由于现有实验室和设备的限制，缺乏体内实验。为了更全面地了解这种LncRNA作为潜在生物标志物的适用性，在后续的临床试验中纳入更大的患者群体将是谨慎的。