miR-421靶向调控Menin/Caspase-3影响抑郁症的机制

刘永辉 谭庆晶 陈清 韦理萍 杨俊威 杨侃 高玉广

广西中医药大学第一附属医院 1脑病科，2康复科，4急诊科 （南宁 530023）；3广西中医药大学 （南宁 530001）

抑郁症是临床常见的精神障碍性疾病，以心境低落、兴趣与偷快感丧失、易疲劳等为主要临床表现。研究显示，全球共有3.22亿人患抑郁症，占全世界总人口的4.4%，2020年，其疾病负担占全球疾病负担的7.5%，仅排在缺血性心脏病之后，居全球非致命性疾病之首［1-2］。目前抑郁症的临床治疗主要以西药治疗为主，约有1/3的患者西药治疗无效［3］，20%～40%患者不能显著缓解病情，且调整用药仍难以奏效，并经历病情的反复，渐而加重病情，致使部分患者走向自杀的道路［4-5］。微小RNA（microRNA，miRNA）属于非编码RNA（non-codingRNA，ncRNA）中的一种［6］，它具有微调多种不同分子过程的潜力［7］，参与了包括神经系统中的炎症反应、神经细胞凋亡、树突生长、突触重塑、胶质细胞增生等多个抑郁症生物学过程［8-9］。miRNA不仅可以辅助诊断抑郁症，还可以预测药物反应和评估疾病的预后［10］。研究表明，miR-421可通过诱导癌细胞凋亡抵抗而使肿瘤消退，而Menin作为miR-421的靶标，过表达Menin可逆转miR-421的神经凋亡作用［11］。另有研究发现，Menin蛋白及其下游因子Caspase-3在抑郁小鼠海马组织中为低表达，抑制Menin、Caspase-3的表达会诱导抑郁样行为的发生［12-13］。由此，推测miR-421可通过调控Menin、Caspase-3的表达而影响抑郁症的相关机制。为此，本研究拟开展动物实验，探究miR-421影响抑郁症的相关机制，为临床治疗抑郁症提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物选取等级为SPF级，日龄为2月龄，品种为SD 健康雄性大鼠，共96只（模型组78只，对照组18只），体质量为（200±20）g，实验动物来源于湖南斯莱克景达实验动物有限公司（合格证号SCXK（湘）2019-0004），本实验已通过动物伦理审查（伦理审核编号 DW20210610-088），实验在广西中医药大学动物实验中心开展。

1.2 抑郁大鼠模型的建立随机取78只大鼠构建抑郁模型。本研究采用腹腔注射脂多糖建立抑郁大鼠模型［14］，将脂多糖与生理盐水配制成浓度为0.5 mg/mL的溶液，单次给予大鼠腹腔注射剂量为0.83 mg/mg，采用糖水偏好度测试和旷场实验检测大鼠的抑郁行为。（1）糖水偏好度测试：将大鼠单笼饲养，提前20 h禁食禁水。准备饮用水和蔗糖水各一瓶，并分别称重。禁食禁水环节结束后，同时将两瓶液体插在鼠笼上给大鼠饮用。1 h后，将两瓶液体中的剩余部分分别进行称量，并计算出前后的差值，即为，用饮用的蔗糖水量除以饮用的的总液体量，得到的值就是大鼠的糖水偏好度。（2）旷场实验（OFT）：将大鼠置于一大小为50 cm× 50 cm × 40 cm、底部黑色、四壁为白色的塑料测试箱内，利用ANY-MAZE采集软件采集实验数据，测试前设定好实验参数，设定采集时间为5 min，记录大鼠进入中央区得次数、中央区的逗留时间和大鼠在箱内的总静止时间。为排除影响实验结果的干扰因素，每只大鼠结束实验后，均需要清除其排泄物，且测试箱的箱底和四壁均要使用75%的酒精进行擦拭，待消毒酒精挥发晾干后再进行下一次测试。

1.3 高通量测序随机取3只抑郁模型大鼠与3只对照组大鼠，使用1 %的戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔注射进行麻醉，待大鼠完全麻醉后，进行开胸，继而剪开右心耳，左心室灌注生理盐水，随后剪开头骨，取出脑组织，将脑组织置于冰块上，快速操作分离出海马组织，研磨成浆液后，使用TRizol（Thermofish-er，China，item number：1218355）进行处理，接着使用miR-Neasy Mini Kit（Qiagen，Hilden，Germany）分离RNA。将扩增后的miRNA与Illumina表达谱微阵列进行杂交，使用cyanine 3荧光标记引物，再次进行扩增、变性，然后与miRNA微阵列杂交，在45～60 ℃的温度下孵育，最后用激光激发成像，使用i Scan系统对荧光强度进行定量成像，进行表达分析。测序以P＜0.05，|log2FC| ≥ 1抑郁为筛选条件，以对照组为参照，筛选到差异表达的miRNAs［15］。

1.4 干预和分组将抑郁组剩余的75只大鼠再随机分为5组，每组15只。分别是∶模型组（腹腔注射脂多糖0.83 mg/mg）、miR-421过表达组、miR-421抑制组、Menin过表达组、Menin抑制组。miR-421抑制组和过表达组采用目的基因重组腺病毒载体（上海齐源生物科技有限公司，No：GMDV0264532）进行干预，用法为每周进行2次干预，一共进行3周，最终使大鼠体内的目的基因发生抑制或者过表达反应。

1.5 各组大鼠体质量变化记录造模前后各组大鼠的体质量值，并计算两者的差值，以此来反映大鼠的食欲变化。

1.6 目标miRNA靶基因预测运用TargetScan数据库（http：//www.targetscan.org/）和miRDB数据库（http：//mirdb.org/）进行miR-421下游靶基因的预测，以保证后续研究分析的顺利进行。

1.7 RNA提取与反转录聚合酶链反应造模后7 d，处死大鼠，分离出大鼠的海马组织，部分用4%多聚甲醛保存以进行免疫组化染色，部分使用Trizol研磨以检测miR-421、Menin、Caspase-3mRNA水平。海马组织经研磨后，参照qPCR试剂盒说明书进行实验。反应体系20 μL：cDNA 1 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，2×Mix 10 μL，ddH2O 8.0 μL。反应条件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，62 ℃45 s，40个循环［16］。采用2-ΔΔCt法计算miR-421、Menin、Caspase-3mRNA水平。引物序列如下表所示。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.8 细胞培养及转染将PC12细胞（武汉普诺赛生命科技有限公司，PM150210B）加入含10%胎牛血清，置于DMEM培养基中，在条件为5% CO2和37 ℃的培养箱中进行培养。通过TargetScan数据库分析得到Menin为miR-421的下游靶点基因之一，使用Lipofectamine 2000转染试剂盒，将Menin过表达载体或阴性对照序列转染至神经元细胞中。24 h后，收集各组细胞进行下一步的实验。

1.9 荧光素酶报告基因实验通过TargetScan数据库分析得到Menin为miR-421的下游靶点基因之一，构建插入荧光素酶的野生型与突变型Menin质粒，并将野生型与突变型Menin质粒分别与miR-421模拟物或阴性对照共转染入PC12细胞中，在加入10 ng海肾荧光素酶测定海肾荧光素酶活性。48 h后，收获细胞并裂解，最后运用双荧光素酶报告分析系统（Promega）检测荧光素酶活性。

1.10 免疫印迹法（Western blot）检测取大鼠海马组织置于1.5 mL离心管中，电动组织研磨棒进行组织研磨，进入蛋白裂解液，裂解5 min后于4 ℃，1 000 r/min，离心10 min，去沉淀组织，留取上清液。测出各样本的蛋白质浓度。然后电泳，分离胶浓度8%，每泳道加入50 μg白样品。待溴酚蓝到达分离胶底部后，进行转膜。转膜完成后将PVDF膜后置于含5%脱脂奶封闭液室温封闭1 h，加入一抗，4℃孵育过夜。次日用WB洗涤液洗PVDF膜3次后，加入二抗，室温孵育1 h。WB洗涤液洗PVDF膜3次后加入3 mL化学发光溶液（ECL），随即进行光敏胶片显像。用Imag J图像分析系统测定信号的灰度值［17］。

1.11 统计学方法采用SPSS 23.0统计软件进行统计分析，计量资料以（）表示，统计分析前进行数据正态分析及数据方差齐性检验，若各组数据为正态分布且各组数据方差齐，则可进行统计分析比较。两两比较采用独立样本t检验，三组及以上比较采用单因素方差分析；若不符合其中一项，则用非参数检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠的抑郁行为及体质量改变抑郁行为方面，对照组大鼠自主活动正常、精神状态正常、饮食正常、自由活动正常。造模后，抑郁组大鼠出现表情淡漠、双眼无神、喜欢独处、活动减少等抑郁行为。各组大鼠体质量方面，造模前，各组大鼠的体质量差异无统计学意义（P＞0.05）；造模后，与对照组比较，模型组大鼠的体质量显著减轻（P＜0.001）；与模型组相比，miR-421抑制组、Menin过表达组大鼠体质量显著升高（P＜0.001），miR-421过表达组、Menin抑制组大鼠体质量明显减轻（P＜0.001）。见表2。

表2 各组大鼠体质量变化Tab.2 Changes in body mass of rats in each group ±s，g

表2 各组大鼠体质量变化Tab.2 Changes in body mass of rats in each group ±s，g

注：与对照组相比，ΔΔΔP＜0.001；与模型组相比，***P＜0.001

组别对照组模型组miR-421过表达组miR-421抑制组Menin过表达组Menin抑制组造模后227.21±5.57 196.23±5.69ΔΔΔ 186.07±3.78***226.87±5.82***226.91±4.89***186.12±4.51***造模前210.40±6.69 209.83±4.21 210.45±4.12 211.23±5.39 211.14±4.93 209.96±4.62

2.2 miR⁃421在抑郁大鼠的脑组织中表达上调测序结果显示，在P＜0.05，|log2FC| ≥ 1的筛选条件下，相对于对照组，在抑郁模型大鼠共有206个差异表达的miRNA，其中上调的miRNA有47个，下调的有159个（图1A、图1B）。PCR结果表明，miR-421在抑郁大鼠海马组织中高表达的（P＜0.001，图1C）。

图1 miR-421参与抑郁的发病过程Fig.1 miR-421 is involved in the pathogenesis of depression

2.3 miR⁃421靶向结合Menin使用TargetScan数据库分析得知Menin作为miR-421的靶点之一（两者的结构结合见图2A）。本研究中，miR-421与Menin的结合关系在双荧光素酶报告基因实验中得到了验证，结果显示，与miR-421-MUT组相比，Menin可明显下调miR-421-WT质粒的相对荧光素酶活性（图2B），提示Menin可与miR-421特异性结合；qPCR结果表明，Menin在抑郁大鼠海马组织中低表达的（P＜0.001，图2C），当过表达miR-421时，Menin的表达会被抑制，当抑制miR-421的表达时，Menin的表达会升高（P＜0.001，图2D、图2E）。

图2 miR-421调控Menin的表达Fig.2 miR-421 regulates the expression of Menin

2.4 糖水偏好度测试和旷场实验结果与对照组比较，模型组大鼠的糖水消耗体积和糖水偏好率均显著降低（P＜0.001）；与模型组比较，miR-421抑制组和Menin过表达组大鼠的糖水消耗体积、糖水偏好率均显著升高（P＜0.001），miR-421过表达组和Menin抑制组大鼠的糖水消耗体积、糖水偏好率均显著降低（P＜0.001）。见表3。旷场实验中，与对照组比较，模型组的运动总距离、中央区运动距离（%）和中央区停留时间（%）显著减少（P＜0.001）；与模型组比较，miR-421抑制组和Menin过表达组大鼠的运动总距离、中央区域运动距离（%）和中央区停留时间（%）均显著增加（P＜0.001），miR-421过表达组和Menin抑制组大鼠的运动总距离、中央区域运动距离（%）均明显减少（P＜0.01），中央区停留时间（%）减少（P＜0.05）。见表4。

表3 糖水偏好实验Tab.3 Sugar water preference experiment ±s

表3 糖水偏好实验Tab.3 Sugar water preference experiment ±s

注：与对照组相比，ΔΔΔP＜0.001；与模型组相比，***P＜0.001

组别对照组模型组miR-421过表达组miR-421抑制组Menin过表达组Menin抑制组糖水偏好率（%）80.16±5.32 36.79±3.94ΔΔΔ 16.53±0.86***70.66±3.72***71.05±3.77***16.65±1.08***糖水消耗体积（mL）14.31±1.12 6.61±0.79ΔΔΔ 3.01±0.50***12.08±0.75***12.24±0.58***3.11±0.37***

表4 旷场实验Tab.4 Open field test ±s

表4 旷场实验Tab.4 Open field test ±s

注：与对照组相比，ΔΔΔP＜0.001，与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

组别对照组模型组miR-421过表达组miR-421抑制组Menin过表达组Menin抑制组中央区停留时间（%）3.93±1.40 1.63±0.78ΔΔΔ 0.80±0.24*4.13±1.49***4.61±1.25***0.84±0.44*运动总距离（CM）1 354.80±281.56 678.93±138.28ΔΔΔ 350.42±245.43**1 364.59±428.18***1 477.53±333.41***357.58±240.46**中央区停留时间（%）9.78±2.53 3.63±1.25ΔΔΔ 1.60±0.62**10.19±2.27***10.41±2.59***1.72±0.55**

2.5 Menin是调控Caspase⁃3信号通路的关键因子qPCR检测提示，Caspase-3、NF-κB在抑郁大鼠模型海马组织中的表达显著提高（P＜0.001），IL-1β在抑郁大鼠模型海马组织中的表达明显提高（P＜0.01），见图3A。免疫印迹检测结果显示，当过表达Menin时，抑郁大鼠的Caspase-3、IL-1β、NF-κB会被下调，当抑制Menin时，抑郁大鼠的Caspase-3、IL-1β、NF-κB会被上调（P＜0.05，图3B）。qPCR检测，也同样得到上述结果（P＜0.05，图3C）。

图3 Menin对Caspase-3信号通路的影响Fig.3 Effect of Menin on Caspase-3 signaling pathway

3 讨论

研究证实腹腔注射LPS可诱导神经炎症反应［14］，抑制神经炎症反应可减轻抑郁样行为［18-20］。本研究结果显示，LPS可致使急性抑郁模型海马组织中miR-421表达上调，降低Menin表达，提高Caspase-3、IL-1β、NF-κB等促炎细胞因子含量，诱导炎症反应，提示抑郁动物模型建立完成。进一步研究发现，Menin与miR-421具有负相关的作用，抑制miR-421表达可上调Menin表达，降低LPS诱导的Caspase-3、IL-1β、NF-κB等促炎细胞因子含量，降低神经炎症反应，从而改善急性抑郁动物模型的抑郁样行为。

神经炎症被广泛认为是抑郁症发生的病理机制之一，主要是通过激活炎性因子的活性，活化机体的炎症反应，进而抑制海马神经的发生，降低海马突触的可塑性，影响中枢神经元色氨酸的代谢，增强交感神经的神经活性，由此来参与抑郁症的发生与发展［21-22］。大量研究表明，miRNA在多条与抑郁症发病相关的生物途径中发挥作用，可被作为抑郁症治疗的潜在生物靶点［23-26］。为进一步探究miRNA对LPS诱导的急性抑郁模型的作用机制，本研究发现，LPS诱导的急性抑郁模型Menin表达降低，Caspase-3表达升高；当抑制miR-421表达后，Menin表达升高，Caspase-3表达降低，且抑郁大鼠的食欲、体质量及运动能力得到恢复，提示抑制miR-421表达可上调Menin表达，降低海马组织中Caspase-3、IL-1β、NF-κB等促炎因子含量，从而发挥抗神经炎症作用，改善抑郁样行为。所以，miR-421可调控Menin/Caspase-3通路改善抑郁样行为，此调控通路可为抑郁症的治疗提供了新的靶点。

综上所述，腹腔注射LPS可诱导神经炎症反应发生，从而建立急性抑郁模型。抑制miR-421表达，可升高Menin表达，降低Caspase-3含量，发挥抗神经炎症作用，恢复抑郁大鼠体重和运动能力，进而改善抑郁症状，为临床治疗抑郁症提供新的方向。但是本研究仅涉及细胞实验，未进行体内实验，且抑郁症机制复杂，神经炎症反应只是其中一个发生机制；且在临床上，抑郁症多为慢性进展，本研究选取急性抑郁动物模型，实验结果会具有一定的局限性。但本研究的结果为将来探究miR-421在抑郁症靶向治疗中的作用提供了理论依据，为今后挖掘更多的靶向治疗信号通路奠定了基础。