百里香精油在果胶甲酯酶响应型抗菌薄膜中的扩散性能及其迁移行为
2024-03-13杨晨浩辛颖刘珍珍闫潇柯刘昆仑
杨晨浩，辛颖，刘珍珍，闫潇柯，刘昆仑
（河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001）
天然大分子薄膜既具备足够的机械性能以保护食品免受机械损伤，又可作为抗菌剂良好的释放载体，减缓抗菌剂与食品直接接触的进度[1-2]，延长抗菌剂作用时间，所制备的抗菌薄膜可在食品中发挥保鲜、抑菌等功效[3]。目前，天然植物精油作为一种广谱抗菌剂和强抗氧化剂成为了食品包装领域的研究热点，但其光热易分解、水溶性差等缺点限制了其作为抗菌剂在薄膜中的应用，因此利用乳液体系将此类物质包埋后作为抗菌剂被广泛应用于薄膜包装中[4]。
目前，卵清蛋白-高甲氧基果胶[5]、花生蛋白-高甲氧基果胶[6]等配合物已被用于包埋此类脂溶性精油，充当抗菌薄膜中抗菌剂。而抗菌剂在天然大分子薄膜、果蔬及两者之间空隙的传质迁移行为影响着抗菌薄膜的保鲜功能[7]。这个过程可运用动力学方程来描述，通过数学建模，既可以为抗菌剂在薄膜中的控制释放提供理论依据，又可预见包装薄膜对食品保鲜效果和有效期，节约试验成本。抗菌剂在薄膜中的迁移扩散行为会受到多种环境因素的影响，目前的研究多集中在pH 值、水分活度及温度等[8]因素，但随着果蔬储藏过程中内源性果胶甲酯酶酶活的不断提升，果蔬表皮细胞壁逐渐水解，使得果蔬表面成为微生物生长的温床[9]，外源微生物所分泌的果胶酶会水解此类抗菌剂中高甲氧基果胶，使得被其包埋的脂溶性精油析出，抑制外界微生物生长，从而赋予负载此类抗菌剂的抗菌薄膜随外界果胶甲酯酶酶活变化的特异响应功能，令其具备在果蔬保鲜中的应用潜力。因此，酶响应抗菌薄膜中抗菌剂传质迁移模型的构建具备研究价值。
因此，本文研究包埋百里香精油的酶响应型抗菌乳清蛋白薄膜在不同果胶甲酯酶酶活条件下的百里香精油扩散行为。根据抗菌剂的扩散规律，确定抗菌膜中百里香精油的扩散系数和扩散指数，建立抗菌膜的酶响应动力学模型，以期为响应型抗菌膜在果蔬保鲜中的应用研究提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 主要材料与试剂
冰乙酸（分析纯）：天津市天力化学试剂有限公司；吐温20（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；果胶甲酯酶（30 000 U/g）：山东隆科特酶制剂有限公司；乳清分离蛋白（食品级）：新西兰恒天然集团；百里香精油：吉安市中香天然植物有限公司；高酯苹果果胶（酯化度60%~70%）：宁波鼎元食品科技有限公司。
1.2 主要仪器与设备
恒温数显磁力搅拌水浴锅（FJS-6）：上海维诚仪器有限公司；测厚仪（GM280F）：深圳华清仪器仪表有限公司；扫描电子显微镜（Regulus8100）：日本日立公司；高速剪切分散乳化机（F18）：上海弗鲁克科技发展有限公司；超声波细胞破碎仪（JY92-IIN）：宁波新芝生物科技股份有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 百里香精油Pickering 乳液的制备
参照Wijaya 等[10]的方法，并稍作修改，将一定质量的乳清分离蛋白（whey protein isolate，WPI）和高甲氧基果胶（high methoxy pectin，HMP）溶于10 mmol/L pH4.5的醋酸缓冲液中，磁力搅拌过夜，使其充分溶解，调节溶液pH 值至4.5，静置15 min 后85 ℃水浴加热15 min，立即采用冰水浴冷却至室温，即可得到乳清分离蛋白-高甲氧基果胶-热诱导（whey protein isolate- high methoxy pectin-heat，W-H-h）复合纳米凝胶即W-H-h 纳米凝胶。向制得的W-H-h 纳米凝胶中加入20%（体积比）的百里香精油，13 500 r/min 剪切30 s 制得粗乳液，然后在超声功率87 W、超声时间1 min、超声间隔2 s、工作温度25 ℃的条件下，使用超声波细胞破碎仪进行乳液的制备。
1.3.2 纳米复合抗菌薄膜的制备
精确称取一定质量的乳清分离蛋白粉，以去离子水溶解后搅拌均匀，制得10.5%（质量分数）的乳清分离蛋白溶液。随后90 ℃条件下搅拌30 min，立即冷却后加入60%（质量分数）的甘油再搅拌均匀[11]，而后加入0.5%（体积比）的百里香精油Pickering 乳液，磁力搅拌15 min，13 500 r/s 高速剪切2 min，得到百里香精油Pickering 乳液-乳清分离蛋白复合膜液[12]。随后将膜液倒入聚乙烯培养皿中，在50 ℃烘箱中干燥3 h，即得纳米复合抗菌薄膜。干燥后的薄膜在25 ℃相对湿度50% 条件下平衡3 d，测试其性能[11]。
1.3.3 薄膜溶胀率的测定
为了研究薄膜的溶胀与扩散性之间的关系，将膜裁成2 cm×2 cm 的膜放在不同果胶甲酯酶酶活的模拟液（质量分数3% 乙酸水溶液+质量分数2% 吐温20）中[13]，每隔一段时间（5、10、15、20、25、30、40、50、60 min）将膜取出用滤纸去除表面多余液体，用天平称重后再放回[14]。每个处理均做3 个平行。按公式（1）计算薄膜溶胀率。
式中：S为薄膜的溶胀率，%；W0为膜初始质量，g；Wt为溶胀过程中不同时刻薄膜的质量，g。
1.3.4 扫描电子显微镜分析
将进入食品模拟液前后的蛋白基抗菌薄膜进行液氮脆断处理，并做好标记，电镜扫描其横断面，对比传质前后薄膜微观结构的变化[15]。测试加速电压5.0 kV，放大倍数800×。
1.3.5 扩散迁移试验
将抗菌薄膜分别裁成2 cm×2 cm 大小，采用测厚仪选取中间和四角5 个点测量膜的厚度，并取平均值。在室温下将裁剪好的膜分别置于果胶甲酯酶活为0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 U/mL 的食品模拟液（质量分数3%乙酸水溶液+质量分数2% 吐温20）中，每隔2 min 吸取3 mL 模拟液，利用紫外分光光度法测定百里香精油吸光值（274 nm），以时间t为横坐标，释放比率（Mt/M∞）为纵坐标绘制释放曲线，直至各组均达到平衡为止[16-17]。其中Mt为t时刻的释放量，M∞为t∞时刻的释放量。
1.4 数据处理
所有数据均采用SPSS 26.0 和Origin 2021 软件进行统计分析及作图。
2 结果与分析
2.1 不同酶活条件下抗菌膜的溶胀率变化
抗菌薄膜在不同果胶甲酯酶酶活的条件下表现出不同的溶胀行为，溶胀行为分析可初步揭示百里香精油在薄膜中的传质扩散。不同酶活下乳清分离蛋白抗菌膜溶胀率的变化如图1 所示。
图1 不同酶活下乳清分离蛋白抗菌膜溶胀率的变化Fig.1 Changes in swelling rate of antibacterial film of whey protein isolate under different enzyme activities
由图1 可知，抗菌膜均有明显的溶胀行为。初始阶段，溶胀率整体呈现出先急剧上升，后较为平缓，最后达到平衡。其原因主要分为3 个方面：第一，pH 值较低时，膜的网络结构中氨基质子化，静电斥力和亲水性增加，导致膜结构疏松，孔道变大，故溶胀率变大[18]；第二，食品模拟体系中的水分子逆向扩散至薄膜中，乳清蛋白在其结构中具有一些亲水性的极性基团，这些基团易于和水相互作用导致聚合物链松弛以及体积膨胀（溶胀）[19]；第三，薄膜中含有的W-H-h 纳米凝胶具有典型的三维网络结构，能够吸引水分子产生较高的溶胀率。此外，抗菌薄膜的溶胀率随模拟液中酶活的升高整体呈现出不断上升趋势。其原因可能为较高的酶活使得乳清分离蛋白-高酯果胶纳米凝胶水解程度加剧，从而导致其包埋的百里香精油逐渐析出，百里香精油的增多使得蛋白膜中产生更多的孔洞、裂缝，薄膜结构因此变得更加疏松，水分子更易同乳清蛋白薄膜中亲水基团结合，故薄膜溶胀率进一步增大。
在薄膜初始溶胀阶段，基本呈现出酶活越高，薄膜溶胀率越大的趋势。而0.5 U/mL 条件下薄膜溶胀率略大于1.0 U/mL 下的溶胀率，这可能是由于酶活1.0 U/mL 时已经非常接近纳米凝胶结构发生进一步转变的临界点，脂溶性的精油分子向模拟液中释放的速率增大至超过薄膜体系对水分子的吸收速率，且油水不相容，从而导致此时水分子在传质通道中的运动受到精油分子的阻碍作用增大。当酶活进一步增大到超过纳米凝胶结构发生进一步转变的临界点时，薄膜体系中的静电斥力进一步增大，孔道也随之进一步变大，导致此时脂溶性的精油分子向模拟液中释放的速率小于薄膜体系对水分子的吸收速率，故当酶活达到1.5 U/mL 之后，薄膜溶胀率随着酶活的上升而逐渐增大。2.5 U/mL 条件下，薄膜溶胀率在后期有所下降，这可能是由于纳米凝胶在活性较大的果胶甲酯酶的长时间作用下，三维网络结构彻底破裂，最终导致已经进入网络中的部分水分子又重新流出。
2.2 电镜分析
蛋白基抗菌薄膜中抗菌剂的传质迁移过程较为复杂，电镜分析可以从表面微观形貌层面初步了解分析薄膜的传质行为。 抗菌薄膜传质前后微观结构如图2所示。
图2 抗菌薄膜传质前后微观结构图（800×）Fig.2 Microstructure of antibacterial films before and after mass transfer（800×）
从图2 可以明显看出，此纳米复合抗菌薄膜在传质前横截面显示出光滑平整的微观结构形态，表明各成膜组分紧密结合，而抗菌薄膜在食品模拟液中发生传质平衡后，其微观结构平整度明显下降，甚至出现孔洞和缝隙，这主要是由于此纳米复合抗菌薄膜的成膜组分具有很强的亲水性，在与食品模拟液接触后，首先扩散速率快、分子量小的溶剂分子向薄膜中渗透，使蛋白基抗菌薄膜溶胀，成膜组分间分子间作用力减弱，然后组成薄膜的分子向食品模拟体系中扩散、溶解，导致抗菌薄膜在传质后聚合物构象发生改变，微观结构由致密逐渐变为疏松。另外，随着酶活的增大，抗菌薄膜的疏松程度逐渐增加。0 U/mL 时，从薄膜传质后横截面图可以看出，其微观结构致密程度下降，并伴有传质迁移孔道的出现；0.5 U/mL 时，薄膜组分之间的致密程度进一步下降，并出现褶皱现象；当酶活进一步增大到1.5 U/mL 时，薄膜横截面出现孔洞和缝隙；2.5 U/mL时，薄膜横截面除了孔洞和缝隙的出现，其整体不平整度较1.5 U/mL 时进一步提升。
2.3 百里香精油的酶响应释放动力学
将抗菌膜置于不同果胶甲酯酶活性的食品模拟液中进行迁移试验，得到的百里香精油扩散比率随时间变化的散点图及拟合曲线如图3 所示。
图3 不同酶活条件下百里香精油的释放动力学曲线Fig.3 Release kinetic curves of thyme essential oil under different enzyme activity conditions
由图3 可知，不同酶活条件下百里香精油的扩散比率Mt/M∞随时间的变化趋势基本相同，当释放初期Mt/M∞<2/3 时释放曲线趋于线性且呈爆发性增长，然后趋于平缓，最后达到平衡。采用Origin 非线性曲线拟合后发现百里香精油在此纳米复合抗菌薄膜中的扩散过程呈现出一定的规律性，这种规律可以用指数函数模型进行拟合。抗菌薄膜中百里香精油在不同酶活的模拟液中达到平衡的时间及扩散系数各不相同。综上，酶活越大，扩散比率越大，达到平衡所需的时间越短。将百里香精油扩散初期的扩散比率随时间变化放大显示在右下角中，可以较为明显地看出，当Mt/M∞<2/3 时，扩散比率基本呈现出酶活越大，扩散比例越大的趋势；且平衡所需时间也呈现出随酶活的增大逐渐减小的趋势。
2.4 百里香精油的传质迁移模型
百里香精油释放比率Mt/M∞随时间变化曲线已在图3 中得以描述，但要研究该体系扩散过程的机理，并对变化规律进行数学模拟，需要依据并建立可靠的模型。已有研究表明抗菌剂的释放动力学大多基于Fick扩散定律。由于可食性薄膜明显的溶胀特性，聚合物大分子被迫重新排列为一个新的构象，单纯依赖Fick扩散定律并不能很好地建立活性物质释放模型。有研究指出，低分子化合物在聚合物基质中的扩散通常由与布朗运动有关的随机现象和由局部系统的距离驱动的松弛现象两种现象同时支配。对这两种机制进行线性叠加是组合它们建立活性物质释放模型的最简单的方法之一[20-21]，即扩散-溶胀叠加模型，公式如下。
式中：M（t）为t时刻百里香精油释放质量，g；MF（t）为随机现象引起的t时刻释放到食品体系中的活性物质释放量，g；MR（t）为结构松弛现象引起的t时刻释放到食品体系中的活性物质释放量，g。
与布朗运动有关的随机现象引起的活性物质的扩散一般用Fick 模型描述，由距离驱动的薄膜结构松弛可用一级动力学方程描述，方程如下。
将MF，∞/M∞定义为XF，且M∞=MF，∞+MR，∞，公式（3）可进一步变形为公式（4）。
式中：MF，∞为随机现象引起的t∞时刻释放到食品体系中的活性物质释放量，g；a为释放平衡时食品体系中活性物质含量与包装材料中活性物质含量的比值；qn表示方程tanqn＋αqn= 0 的非零正根；t为扩散迁移时间，s ；XF为活性物质的释放行为偏离Fick 模型的衡量参数；D为扩散系数，m2/s；L为抗菌薄膜厚度，m；τ为与聚合物弛豫相关的弛豫时间，s。
短时间内，当Mt/M∞<2/3 时，抗菌薄膜中活性物质的释放可以由Fick 模型的简化方程来描述，即短时释放模型，公式如下。
式中：D为动态扩散系数，m2/s；L为抗菌薄膜厚度，m。
经拟合计算可得，不同酶活条件下百里香精油抗菌膜的初期扩散系数D如表1 所示。
表1 抗菌薄膜在不同酶活下的扩散指数n，k 值及扩散系数DTable 1 Diffusion index n，k value and diffusion coefficient D of antibacterial films under different enzyme activities
由表1 可知，百里香精油在抗菌薄膜中的扩散系数的数量级为10-13，表明该乳清分离蛋白薄膜作为抗菌载体具有较好的缓释作用[18]。另外，随着酶活的升高，扩散系数出现逐渐增大趋势，这可能是由于果胶甲酯酶和纳米凝胶中的果胶分子发生了不同程度的反应，使得薄膜疏松程度加剧，这与图1 的薄膜溶胀率结果以及图2的薄膜传质前后微观结构变化结果基本相符。
为确定抗菌薄膜中百里香精油的初期迁移机制，将迁移曲线的前面部分（当Mt/M∞<2/3 时）代入幂律模型函数[22]。
式中：k 表示描述大分子空间结构特征的常数；n表示活性物质的扩散指数表示迁移机理。主要分为以下4 种情况：n≤0.5 时，菲克第一定律；0.5
当Mt/M∞<2/3 时，扩散指数n值和常数k 值可通过ln（Mt/M∞）对lnt的斜率和截距求得，作关于lnMt/M∞对lnt的线性关系图如图4 所示。
图4 0.5 U/mL 酶活条件下的抗菌膜ln（Mt/M∞）对lnt 图Fig.4 Plot of ln（Mt/M∞）against lnt of antibacterial film at 0.5 U/mL enzyme activity
抗菌薄膜在0~1.5 U/mL 模拟液中n值较高，介于0.5~1.0 之间，属于不规则扩散。而在1.5~2.5 U/mL 的食品模拟液中n值均较低，介于0~0.5 之间，迁移机理为菲克第一定律。然而，n值随酶活的升高，表现出逐渐下降趋势。由表1 可知，相关系数R2均大于0.9，拟合度较高，表明幂律模型能够较好地描述纳米复合抗菌薄膜中百里香精油的初期扩散行为。
短时释放模型和幂律模型虽然已被广泛应用，能够对百里香精油扩散系数和传质迁移机理进行初步判定分析，具有一定的指导意义，但其仅限于模拟当Mt/M∞<2/3 时百里香精油的扩散，为了模拟百里香精油释放的全过程，本文参考扩散-溶胀叠加模型中的公式（4），提出一种负指数生长回归模型，公式如下。
式中：AF为菲克扩散行为的系数；AR为非菲克扩散行为（松弛现象）的系数；L为抗菌薄膜厚度，m；τ为与聚合物松弛相关的松弛时间，s。
采用Origin 软件中非线性拟合估算指数函数模型方程中AF、AR、τ值，估算迭代方法采用Levenberg-Marquardt，收敛准则为0.000 01，通过无数次的拟合计算，发现该负指数生长回归模型能够很好地描述百里香精油在整个过程中地传质迁移规律。另外，参考蒋硕等[15]的研究，引入2 个扩散行为因子BF、BR。其中，BF表示传质过程中理想菲克扩散行为的权重/因子[BF=|AF|/（|AF|+|AR|）]；BR表示传质过程中，非菲克扩散行为（松弛行为）所占的权重/因子，或称为理想菲克扩散行为的偏离因子[BR=|AR|/（|AF|+|AR|）]。得到的传质参数、精度指标及扩散行为因子见表2。
表2 自拟传质模型参数和相关系数Table 2 Self-fitting mass transfer model parameters and correlation coefficients
负指数生长回归模型最显著的特点是能够通过AF、AR等系数较直观简洁地反映出传质过程中，松弛行为的程度或其对理想Fick 扩散的偏离度，并使运动矢量化，能通过系数的正负值，体现出两类运动的逆向性。从表2 可以看出，自拟模型与试验数据的相关性系数R2极高（R2>0.98），偏差小，置信度高，而且在所有酶活条件下均大于幂律模型的相关性系数R2。通过非菲克扩散行为（松弛行为）因子BR值可知，所有样品均表现出较高的松弛行为；τ 值显示，抗菌薄膜在所有酶活条件下均具有较长的松弛时间，且随着酶活的增大，松弛时间整体呈现下降趋势；同时AR值均接近于1.0，AF值均接近于0，表明该纳米复合抗菌薄膜在不同酶活条件下，百里香精油的释放行为较大程度地偏离了理想Fick扩散，溶胀松弛行为占主导地位。另外，随着酶活的升高，AR整体上呈现逐渐下降趋势，且AF值整体呈现逐渐上升趋势，说明随着酶活的升高，百里香精油的释放机理由不规则扩散向Fick 定律转变，这可能是由于在酶活极限大或者酶活达到一定数值时，该纳米复合抗菌薄膜中百里香精油的释放不再受薄膜本身松弛现象的影响，也就是说当薄膜进入酶活足够大的食品模拟液的瞬间，其溶胀率在极短时间内被放大到极限值，百里香精油后期扩散不再受薄膜溶胀导致的聚合物松弛行为的影响，彻底由菲克扩散行为主导。
图5 为负指数生长回归模型方程的模拟曲线与试验观察值（0.5 U/mL）间的匹配关系。
图5 自拟模型方程与试验观察值的匹配度Fig.5 The matching degree between the self-fitting model equation and the experimental observations
由图5 可知，模拟方程曲线与试验观察值之间吻合度相当高。此外，模型预测值与观察值间显示出高度线性关系，表明该模型能够精确地模拟本纳米复合抗菌薄膜中百里香精油的传质迁移过程，具有较高的置信度。
3 结论
本文通过测定纳米复合抗菌薄膜在不同果胶甲酯酶活性的果蔬食品模拟液中的薄膜溶胀率、微观结构以及百里香精油的扩散性变化，探究其响应规律，并利用百里香精油扩散指数初步分析其传质迁移机理，最后通过非线性曲线拟合方法建立百里香精油的传质迁移模型，得到结果如下。
1）抗菌薄膜溶胀率和扫描电镜结果表明，抗菌薄膜均具有明显的溶胀行为，且溶胀率整体呈现出先急剧上升后趋于平缓的趋势；传质前后抗菌薄膜聚合物的构象发生了改变，薄膜疏松程度与溶胀率皆表现出随果胶甲酯酶酶活提升而不断增大的趋势。
2）百里香精油释放动力学结果显示，不同酶活条件下，薄膜中百里香精油的扩散比率Mt/M∞随时间的变化趋势基本相同，皆呈现出初期急剧增长，后趋于平缓，最后达到平衡的趋势。且在释放初期Mt/M∞<2/3时，扩散速率随果胶甲酯酶酶活的提升而不断增大，平衡时间随果胶甲酯酶酶活的提升而不断减小。
3）百里香精油短时释放模型和幂律模型分析结果显示，该乳清分离蛋白薄膜作为抗菌载体具有较好的缓释效果，且百里香精油的扩散系数随果胶甲酯酶活性的增大而增大；另外，发现在酶活处于0~1.5 U/mL时，百里香精油的初期释放动力学属于不规则扩散，而在其它条件下遵循菲克第一扩散定律。
4）自拟的负指数增长回归模型可描述百里香精油迁移扩散全过程，且拥有较高的拟合度。自拟模型显示，随着酶活的升高，百里香精油的释放机理呈现出由不规则扩散向Fick 定律转变的趋势。
