高效液相色谱法测定柴桂解表颗粒中黄芩苷含量的研究

成程，陈向梅，马健，张沂

柴桂解表颗粒是一种纯中药制剂，主要的功效是表里双解、清热解毒，由解放军总医院第六医学中心（原海军总医院）研发，是该院非标准制剂，主要中药成分有黄芩、麻黄、桂枝、白芍、柴胡等，临床上用来治疗急性上呼吸道感染［1］，证属卫分受寒，肺有蕴热，症状可见发热、头痛、咽痛、鼻塞、流涕等。该制剂已建立的质量分析方法包括主要药味桂枝、黄芩、麻黄和甘草的薄层鉴别，指标成分芍药苷的含量测定等［1-2］。为进一步完善柴桂解表颗粒的质量标准，本研究参考2015 年版《中国药典》［3］及黄芩苷相关检测文献［4-5］建立柴桂解表颗粒中黄芩苷含量的高效液相色谱法（high performance liquid chromatography， HPLC）测定方法，该方法灵敏、准确，可取代黄芩薄层色谱鉴别作为柴桂解表颗粒质量标准之一。

1 材料与方法

1.1 仪器

1200 高效液相色谱仪、VWD 检测器和HP 二维化学工作站，均为美国安捷伦公司产品；紫外可见分光光度计（日本岛津，型号UV-2450）；电子分析天平（上海梅特勒托利多公司，型号PL203）。

1.2 试剂

黄芩苷标准品（中国药品生物制品检定所提供，批号为110715-201318，供含量测定用，含量以93.3% 计）；柴桂解表颗粒样品由解放军总医院第六医学研究中心（原海军总医院）提供（3 批次的批号分别为：20141015、20150201、20150425）；甲醇为色谱纯，磷酸为分析纯，水为自制超纯水。

1.3 色谱条件

色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相为甲醇-磷酸-水（47∶0.2∶53）；流速为1.0 ml/min；进样量为5 μl；柱温：40 ℃，检测波长为335 nm［6］。

1.4 溶液制备

1.4.1 对照品溶液的制备 取黄芩苷标准品适量，60 ℃减压干燥4 h，精密称定，加甲醇制成每1 ml 含黄芩苷40 μg 的溶液作为对照品。

1.4.2 供试品溶液的制备 准备供试品溶液之前，分别对取样量、溶剂、提取溶剂量、提取方法做选择实验。测定结果确定供试品的取样量为0.4 g时单位重量峰面积最大，见表1。不同溶剂提取测定结果表明70%乙醇提取效果较好，见表2。提取溶剂量的选择结果表明70% 乙醇50 ml 能将有效成分提取完全，见表3。提取方法的选择结果表明选用超声20 min 的提取方法处理效果比较好且简单，见表4。供试品溶液制备：精密称定研细后的柴桂解表颗粒样品0.4 g，置于200 ml 具塞锥形瓶中，精密加入70% 乙醇50 ml，密塞，称定重量，超声处理（功率200 W，频率40 kHz）20 min。放至室温后再称定重量，减失的重量用70% 乙醇补足，摇匀后过滤，滤液即为供试品溶液。

表1 不同取样量提取后的测定结果

表2 不同溶剂提取测定结果

表3 不同乙醇量提取后测定结果

表4 不同提取方法测定结果

1.4.3 阴性对照品溶液制备 依照柴桂解表颗粒处方中各味中药的比例，去掉黄芩，按其工艺制成阴性制剂，按1.4.2 节的方法制备阴性对照品溶液。

1.5 统计学处理

数据采用Excel 软件进行统计分析。

2 结果

2.1 系统适用性

分别取对照品、供试品和阴性对照品溶液各5 μl 进样，分别进行HPLC 分析，记录色谱图，见图1。在供试品的色谱图上，与对照品对应的位置上有色谱峰出现，主峰与其他成分分离良好。阴性对照品的色谱图中，在相应的出峰时间处无干扰峰出现，系统适用性良好。

图1 黄芩苷对照品、柴桂解表颗粒供试品和阴性对照品HPLC 色谱图

2.2 考察线性关系

精密称取黄芩苷标准品10.95 mg，置于25 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，制成408.7 μg/ml 的溶液，作为对照品贮备液。分别精密量取对照品贮备液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、5.0 ml 置于5 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液各5 μl，进样测定。以峰面积为纵坐标，黄芩苷进样量为横坐标，回归得标准曲线方程为：y=2 693x-4.98，相关系数r=1，这表明黄芩苷在0.045 87～2.293 50 μg/ml 范围色谱峰面积和进样量呈良好的线性关系。

2.3 精密度试验

精密吸取8.17 μg/ml 黄芩苷对照品溶液5 μl，进行HPLC 测定，记录峰面积。重复测定6 次，计算得相对标准偏差（RSD）=0.3%，说明仪器精密度良好。

2.4 重复性试验

精密称取20150425 批次柴桂解表颗粒样品6 份，分别制备供试品溶液，进行HPLC 分析，记录HPLC 峰面积。黄芩苷含量平均为4.36 mg/g，RSD=1.33%，说明本方法重复性良好。见表5。

表5 重复性试验测定结果

2.5 加样回收率试验

精密称取20150425 柴桂解表颗粒（黄芩苷含量4.36 mg/g）样品0.16、0.20、0.24 g，每个重量各3 份，分别精密加入适量的黄芩苷标准品。按供试品溶液的制备方法制备加样回收测定溶液，HPLC测定其黄芩苷含量，并计算回收率，回收率为97.85%～101.68%，平均为99.6%，加样回收良好。见表6。

表6 加样回收率试验结果

2.6 流动相比例的选择

流动相选用甲醇-磷酸-水（45∶0.2∶55），甲醇-磷酸-水（47∶0.2∶53），甲醇-磷酸-水（49∶0.2∶51），见图2～4。最终选定甲醇-磷酸-水（47∶0.2∶53）的流动相系统，可使黄芩苷达到基线分离。

图2 流动相甲醇-磷酸-水（45∶0.2∶55）

图3 流动相甲醇-磷酸-水（47∶0.2∶53）

图4 流动相甲醇-磷酸-水（49∶0.2∶51）

2.7 样品测定

不同色谱柱的比较，选用了2 种色谱柱进行比较：Discovery C18Cat#：504971 HPLC Column（4.6 mm×250 mm， 5 μm）和 Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150 mm， 5 μm），见图5、6。由图可见C18色谱柱均能很好地使黄芩苷达到基线分离，方法学验证采用的是Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150 mm， 5 μm）色谱柱。

图5 色谱柱Discovery C18 Cat #：504971 HPLC Column（4.6 mm×250 mm， 5 μm）

分别取柴桂解表颗粒3 个批次的样品，制备供试品溶液。取每个批次的供试品溶液5 μl 进样分析，计算黄芩苷含量，结果见表7。3 批柴桂解表颗粒中的黄芩苷含量分别为4.07、4.11、4.40 mg/g，初步制定柴桂解表颗粒质量分析标准中的黄芩苷含量为4～4.5 mg/g。

表7 样品中黄芩苷含量测定结果

3 讨论

黄芩是柴桂解表颗粒中的主要成分，黄芩苷也是主要功能成分之一。在前期制定柴桂解表颗粒质量标准的过程中，由于提取工艺的原因，未能从黄芩中提取出黄芩苷，只能用汉黄芩素作为对照品对黄芩进行薄层色谱鉴定［1］。本试验对黄芩的提取工艺进行了研究，比较了纯甲醇、80% 甲醇、纯乙醇、70%乙醇、50%乙醇的提取效果，试验结果表明70% 乙醇提取黄芩苷的效果较好。以70% 乙醇为溶剂，提取方法分别采用加热回流30、60、120 min，超声20、30、60 min，结果表明选用超声20 min 的方法提取率较高。柴桂解表颗粒样品溶于70% 乙醇中，超声提取20 min 后可提取出黄芩苷用于HPLC检测。

经过专属性试验、线性关系考察、精密度试验、重复性试验、加样回收率试验等方法学考察，结果显示HPLC 用于柴桂解表颗粒中黄芩苷含量的测定，结果准确可靠，操作简便易行，可以作为柴桂解表颗粒质量标准使用。