四川省部分地区牛结核病感染情况调查

黄雅琳，杨天俊，李盛琼，高 露，冯春红，梁兴新，尹 杰*

（1.四川省动物疫病预防控制中心，四川 成都 610041；2.四川省宣汉县动物疫病预防控制中心，四川 宣汉 636150；3.四川省峨眉山市农业农村局，四川 峨眉山 614200）

牛结核病是一种传染性强的慢性消耗性人畜共患病，由牛分支杆菌、结核分支杆菌等病原引起，其中牛分支杆菌的致病性最强，主要侵害肺及淋巴结，使之出现干酪性坏死灶和慢性炎性肉芽肿［1］。该病对水牛、黄牛、牦牛、鹿等多种动物易感［1］，呈世界性分布，世界动物卫生组织将其列为B 类传染病，我国将其列为二类动物传染病。该病无季节流行性，可通过被污染的空气、饲料和饮水等经呼吸道和消化道感染健康牛，怀孕的母牛也可以通过胎盘传染胎儿。人一般通过食用未经巴氏消毒的生乳及乳制品感染［3］，饲养员、兽医等从业人群也容易感染此病。

随着我国奶牛业和肉牛业的蓬勃发展以及国内外牛产品的频繁交易，牛结核病在许多国家普遍流行，发病率呈逐年上升趋势。目前，我国对牛结核病的检疫通常使用牛型提纯结核菌素（PPD）皮内变态反应法，此方法适用于牛出生后20 d的活体检查。体外检测IFN-γ法也已纳入国家标准，其基本原理是PPD递呈到全血中的淋巴细胞后，感染过牛分枝杆菌的细胞在牛分枝杆菌抗原的再次刺激下能产生高水平的IFN-γ，未感染的不会产生，通过检测IFN-γ浓度水平来判断机体是否感染结核病。

本研究选取X 县、E 县、Z 县等5 个地区的部分牛场进行随机采样，通过PPD皮内变态反应和体外检测IFN-γ法分别对牛结核病的感染情况进行调查，以进一步加强全省牛结核病的防控工作，保障畜牧业生产安全和公共卫生安全。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 牛型提纯结核菌素（20头份/瓶），购自中牧实业股份有限公司成都药械厂，批号：1 605003；牛结核病IFN-γ夹心ELISA 检测试剂盒（480 孔/盒），购自青岛瑞尔唯特生物技术有限公司，批号：2203001。

1.2 试验用牛 在四川省的X、A、E、Z、K县（市、区）各选取14个牛场，随机抽选413头牛作检测。

1.3 PPD 皮内变态反应 参照动物结核病诊断技术（GB/T 18645-2002）进行，采用牛型提纯结核菌素（PPD）在牛颈部进行皮试变态反应，剂量为2 000 IU/头，分别于注射前和注射后72 h测量皮肤厚度，计算出皮厚差，并依据国家标准判断结果。

1.4 牛结核病体外检测IFN-γ法 采用IFN-γ夹心ELISA法进行检测。

1.4.1 全血培养 采集牛抗凝全血后，在8 h 内加入24 孔组织培养板，每份全血分3 孔，依次分别加入牛结核菌素（PPDB）、禽结核菌素（PPDA）和磷酸缓冲盐溶液（PBS），混匀后37 ℃培养孵育16～24 h，然后吸取上层血浆至1.5 mL EP管中。

1.4.2 IFN-γ试验 加入前面吸取的100 μL上层血浆至相应孔中，封板，室温孵育。洗涤后加入酶标抗体，封板，室温孵育。洗涤后加入底物显色溶液，封板，避光孵育15 min。加入终止液，5 min内酶标仪读取OD450nm值。

1.4.3 结果判定 结果的有效性判定：阳性对照OD 值＞0.7，阴性对照OD 值＜0.2。阳性判定：PPDB的OD值-PBS的OD值≥0.1。且PPDB的OD 值-PPDA 的OD 值≥0.1；阴性判定：PPDB 的OD值-PBS的OD值＜0.1，或PPDB的OD值-PPDA的OD值＜0.1。

2 结果

2.1 两种方法的阳性检出率比较 在被检的413头牛中，采用PPD皮内变态反应（GB/T 18645-2002）判定牛结核病阳性数为16 头，阳性检出率为3.87%。采用体外检测IFN-γ法（GB/T 32945-2016）判定牛结核病阳性数为12 头，阳性检出率为2.91%（表1）。

表1 两种方法的阳性检出率比较

2.2 两种方法的符合率比较 对413 头牛分别用PPD 皮内变态反应和体外检测IFN-γ法检测，结果显示：这两种方法的阳性符合数为11 头，阳性符合率为78.57%；阴性符合数为396 头，阴性符合率为99.25%（表2）。

2.3 四川省5个县（市、区）部分牛场的阳性率比较 体外检测IFN-γ法是世界动物卫生组织认可的一种辅助诊断试验方法［4］，以体外检测IFN-γ法作为结果判定标准。这5个地区所有被抽检牛场中，牛结核病的平均阳性率为2.95%，阳性检出率由高到低依次为：E＞A＞K＞Z＞X（表3）。其中大型规模养殖场的阳性检出率为5.00%，小型养殖场的阳性检出率为2.55%（表4）。不同种类牛群中，阳性检出率由高到低依次为：奶牛＞牦牛＞肉牛（表5）。

表3 各地区阳性检出率比较

表4 养殖场类型比较结果

表5 不同种类牛群的阳性检出率比较

3 讨论

牛结核病主要通过实验室方法诊断，实验室诊断方法分为细菌学检测方法、分子生物学诊断技术、免疫学检测技术［5］，其中免疫学检测技术主要包括PPD 皮内变态反应、体外检测IFN-γ法等。

有研究表明，体外检测IFN-γ法和PPD 皮内变态反应具有互补关系，这两种方法联合使用被认为是提高牛结核病检测准确率的有效方法［6］。我国大部分地区对牛结核病的流行病学调查、进出口检疫等依然采用PPD皮内变态反应［7］。该方法的免疫学诊断试剂PPD是多种抗原的混合物，所含抗原为致病性分枝杆菌、环境分枝杆菌等，因此存在一定的交叉反应和非特异性反应，可能产生假阳性现象。基于该方法的原理，PPD 只能用于感染早期的检测，感染后期的检出率极低，会漏检部分感染牛。由于迟发性变态反应的影响，对于疑似病牛，该方法只能在30 d 后进行复检，容易造成病原扩散和疫情处置延误。此外，天气因素、人为因素等也会影响实验结果［8］。

IFN-γ法是一种灵敏度高、特异性强的牛结核病体外检测方法，该方法一般作为PPD 皮内变态反应的辅助检测方法［9］。该方法可以区分牛分枝杆菌、副结核或禽分枝杆菌等的感染，减少了假阳性，仅需采一次血，重复性好，易于标准化，对结核病感染后期的牛检出率较高，但该方法成本高，需由实验室专业人员操作，无法广泛普及。

本研究通过PPD 皮内变态反应和体外检测IFN-γ方法结合，对四川省5个县（市、区）的部分牛场开展结核病流行病学调查，结果发现两种检测方法的阳性符合率高，其中PPD皮内变态反应的阳性检出率略高于体外检测IFN-γ方法，体外检测IFN-γ方法的准确度高，证实了PPD 皮内变态反应方法可能存在部分非特异性，体外检测IFN-γ方法可作为辅助手段用于牛结核病的诊断和监测。另外，大型养殖场的阳性率略高于小型养殖场，其中肉牛结核病阳性率最低，奶牛结核病阳性率最高。这可能是由于奶牛对结核病更易感，而牦牛主要以散养放牧为主，间接促进了牛结核病的传播。

在实际应用中，养殖场可以进行一年两次的结核病检疫。对于有条件的养殖场，可以先用PPD 皮内变态反应试验进行初筛，再对阳性牛应用体外检测IFN-γ法复检，不仅避免部分错筛带来的经济损失，还可以避免疫情扩散。若养殖场能坚持自繁自养，且严格按照要求对结核病阳性牛进行隔离、扑杀，并做好养殖场的消毒，连续2～3年将可能达到净化牛结核病的目的。

4 结论

本研究采用PPD 皮内变态反应和体外检测IFN-γ法对四川省牛结核病进行了流行病学调查，得出牛结核病阳性率在3%左右。分析两种方法的检测结果，发现体外检测IFN-γ法的阳性率低于皮内变态反应。因此，确诊牛结核病比较理想的方法是两种或两种以上方法的联合使用，在实际检疫中单独使用PPD 皮内变态反应方法会造成假阳性牛的误杀，应通过体外检测IFN-γ法对变态反应阳性牛和可疑牛进行复检，综合判断确诊，以利于牛结核病的净化。