楮实子预处理对对乙酰氨基酚致L02 细胞损伤的保护作用

韩世诚 王婷婷 张一昕 王 茜 柴天川

1.河北中医药大学药学院，河北石家庄 050091；2.河北省中医院制剂科，河北石家庄 050091

药物性肝损伤（drug induced liver injury，DILI）是由药物引起的常见不良反应之一，据报道，对乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）是引起肝衰竭的主要因素之一[1]。长期大量使用APAP，过量产物N-乙酰苯醌亚胺攻击线粒体，破坏其结构，增加通透性，降低膜电位；损伤活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）的防御体系，增加线粒体ROS 生成，激活线粒体内c-jun氨基末端激酶（C-Jun N-terminal kinase，JNK），促进线粒体不断产生ROS，导致线粒体膜脂质过氧化[2-5]。ROS的过量产生又可引起内质网应激，从而激活增强子CCAAT 结合蛋白同源蛋白（CHOP）转录，促进细胞凋亡，进一步诱发肝损伤。楮实子味甘，气寒，无毒，入肾、肝二经。具有滋肾益阴、清肝明目等功效。前期研究证实，楮实子能够改善APAP 所致肝损伤大鼠的氧化应激及炎症反应，并对线粒体形态损伤有一定的修复作用[6-7]。为了进一步探究其基于线粒体损伤的护肝作用机制，本研究采用APAP 损伤人正常胚胎肝细胞株L02 后，用楮实子水提物加以干预，通过检测细胞存活率及细胞内ROS 水平、线粒体膜电位水平、JNK、GRP78、CHOP 蛋白表达水平，在体外分子水平验证楮实子护肝作用机制。

1 对象与方法

1.1 实验细胞

人正常肝细胞L02 细胞，河北医科大学惠赠。

1.2 主要药品与试剂

楮实子提取物（1 g 水提物=10 g 饮片），西安汇林生物科技有限公司提供，批号：HL- 210120；楮实子粉碎后、加热煎煮，过滤得到药液，通过喷雾干燥设备雾化后在热风作用下快速蒸发和凝固，得到楮实子提取物，密封容器保存，按照需要的浓度稀释于RPMI-1640 基础培养基中。JNK 抗体、GRP78 抗体、p-JNK抗体（批号：GB12002、GB11098、GB13019-1）；CHOP 抗体（批号：15204-1-AP）。

1.3 实验方法

1.3.1 楮实子水提物安全剂量的筛选 将细胞分为正常组，对照组和不同浓度（0.1、0.3、1.0、3.0、10.0 mg/ml）的楮实子水提物溶液，每组6 个复孔，选用CCK-8 计算细胞存活率，选取存活率适宜的楮实子浓度进行后续实验。存活率=（实验组OD 值-正常组OD 值）/（对照组OD 值-正常组OD 值）×100%。

1.3.2 APAP 损伤致L02 细胞损伤条件的筛选 将细胞分为正常组、对照组、不同浓度（5、10、20、40、80 mmol/L）APAP 损伤组，选用CKK-8 检测细胞存活率，选择导致50%细胞存活率的APAP 浓度建立体外肝细胞损伤模型[8]。

1.3.3 楮实子水提物对APAP 损伤的L02 细胞的干预 对楮实子水提物有效剂量及APAP 致L02 肝细胞损伤剂量进行筛选后，在96 孔板中接种L02 细胞，每孔100 μl，分为正常组、APAP 组和楮实子干预组，每组6个复孔，在培养箱中培养12 h。APAP 组和楮实子干预组加入40 mmol/L 的APAP 溶液，继续培养12 h。楮实子干预组加入含生药量1 mg/ml 的楮实子水提物，继续培养12 h。计算细胞存活率。

1.4 观察指标及检测方法

1.4.1 细胞凋亡情况观察 将对数生长期L02 细胞以1×106个/ml 的浓度接种于6 孔板中，按“1.3.1”培养方法和药物干预。添加Hoechst 33258 染液（每孔1 ml），CO2培养箱中避光孵育20 min。吸除染液，PBS 缓冲液洗涤3 次，每次2 min。在荧光显微镜下拍摄荧光图片（激发波长352 nm，发射波长461 nm）比较细胞凋亡情况。

1.4.2 ROS 含量检测 DCFH-DA 法测定L02 细胞内ROS 水平。将细胞按“1.3.1”培养方法和药物干预接种于6 孔板中，PBS 洗涤3 次。加入1.5 ml 终浓度为10 mol/L 的DCFH-DA 溶液。对照组添加活性氧供氢体。在37 ℃培养箱中处理30 min。去除DCFH-DA 溶液，用PBS 洗涤细胞3 次，离心后用PBS 悬浮细胞。倒置荧光显微镜下观察并拍照（激发波长488 nm 和发射波长525 nm）。

1.4.3 JNK、p-JNK、GRP78、CHOP 蛋白表达 超低温下提取蛋白，经电泳、转膜、封闭后，加入一抗GAPDH（稀释比为1∶2 000）、p-JNK（稀释比为1∶800）、JNK、GRP78、CHOP（稀释比为1∶1 000）4 ℃过夜。洗膜，加入二抗（稀释比：1∶3 000），在室温下孵育30 min，显影，获取图像。

1.4.4 线粒体膜电位表达 将细胞接种于6 孔板中的载玻片上，按“1.3.1”培养方法和药物干预。PBS 冲洗3次，将罗丹明母液加入培养基制成染液，加入6 孔板中，37 ℃避光孵育15 min。吸出染液，用PBS 冲洗3次，倒置荧光显微镜下观察并拍照。

1.5 统计学方法

采用SPSS 25.0 统计学软件进行数据分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 楮实子水提物有效剂量筛选

在0.1 mg/ml 浓度下，楮实子水提物对细胞存活率的影响较小，随着浓度的增加，细胞存活率逐渐降低。在0.3 mg/ml 及更高的浓度下，存活率受到更大的抑制。与0.1 mg/ml 楮实子水提物比较，0.3、1.0、3.0、10.0 mg/ml 楮实子水提物细胞活性降低，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。楮实子水提物为1 mg/ml 时，细胞存活率开始趋于平缓，因此以生药量1 mg/ml 进行后续实验。见图1。

图1 楮实子水提物对L02 细胞存活率的影响

2.2 APAP 致L02 肝细胞损伤剂量筛选

细胞存活率随APAP 浓度增加而降低，当APAP给药浓度为40 mmol/L 时，细胞存活率为50%，因此，以APAP 浓度为40 mmol/L 进行后续造模实验。见图2。

图2 APAP 对各组L02 细胞存活率的影响

2.3 各组细胞存活率及细胞凋亡平均荧光强度值比较

与正常组比较，APAP 组细胞存活率下降，细胞凋亡平均荧光强度值升高（P＜0.05）；与APAP 组比较，1 mg/ml 楮实子水提物细胞存活率升高，细胞凋亡平均荧光强度值降低（P＜0.05）。见图3、表1。

表1 各组细胞存活率及细胞凋亡平均荧光强度值比较（±s）

表1 各组细胞存活率及细胞凋亡平均荧光强度值比较（±s）

注与正常组比较，aaP＜0.01；与APAP 组比较，bbP＜0.01。APAP：对乙酰氨基酚。

图3 各组L02 细胞凋亡情况（200×）

2.4 各组L02 细胞ROS 含量比较

APAP 组ROS 荧光强度值为（65.02±5.43），高于正常组的（16.87±3.85），差异有高度统计学意义（t=17.719，P＜0.01）；楮实子组ROS 荧光强度值为（21.19±3.25），低于APAP 组的（65.02±5.43），差异有统计学意义（t=16.965，P＜0.01）。见图4。

图4 各组L02 细胞内ROS 含量变化（200×）

2.5 各组L02 线粒体膜电位平均荧光强度值比较

APAP 组线粒体膜电位平均荧光强度值为（25.67±3.78），低于正常组的（58.36±2.54），差异有高度统计学意义（t=17.582，P＜0.01）；楮实子组线粒体膜电位平均荧光强度值为（42.18±2.83），高于APAP 组的（25.67±3.78），差异有高度统计学意义（t=8.564，P＜0.01）。见图5。

图5 各组L02 细胞内线粒体膜电位变化（200×）

2.6 各组L02 细胞JNK、p-JNK、GRP78、CHOP 蛋白表达水平比较

各组JNK 蛋白表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。与正常组比较，APAP 组p-JNK、GRP78、CHOP 蛋白表达水平升高（P＜0.01）；与APAP 组比较，楮实子组p-JNK、GRP78、CHOP 蛋白表达水平降低（P＜0.01）。见图6。

图6 各组L02 细胞内JNK、p-JNK、GRP78 和CHOP的蛋白表达水平比较

3 讨论

研究显示，肝细胞受损的核心机制是氧化应激，ROS 作为氧化反应的副产物是氧化应激启动和加重的关键环节，ROS 过度产生引发的内质网应激、线粒体功能障碍、炎症等致使肝损伤的发生[7，9]。本研究采用人肝细胞作为体外模型的细胞系，探讨药物的肝毒性和治疗药物的有效性[10]。荧光显微镜下观察荧光变化，反映ROS 含量，结果显示APAP 组L02 细胞内荧光强度明显增强，细胞存活率降低；楮实子组L02 细胞内荧光强度减弱，细胞存活率升高。提示楮实子能降低ROS 含量，从而缓解APAP 对肝细胞的损伤。

线粒体是细胞内产生ROS 的主要地点，线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）下降与细胞凋亡相关[11-14]。同时，过量的ROS 还可激活JNK 信号通路，加剧氧化应激ROS 的产生，另一方面激活JNK 可诱导线粒体膜通透性改变，加重线粒体损伤[15-16]。本研究结果显示，APAP 组L02 细胞pJNK表达升高；楮实子组pJNK 表达降低，表明楮实子可通过减少ROS 产生，抑制JNK 活化，修复线粒体膜通透性，减少ROS 产生，抑制肝细胞凋亡。

内质网应激在氧化应激引发的级联反应中扮演关键角色，在多种肝脏疾病中均有所存在[17-20]。内质网应激标志蛋白GRP78 的表达，是评价内质网应激水平的指标，能促进肝细胞功能的修复[21]。但内质网应激发生时，GRP78 的表达并非恒定。在对抗肝细胞损伤过程中，GRP78 表达量先升高，到峰值后逐渐下降，为细胞凋亡做准备[22-23]。与此同时，内质网相关的促凋亡蛋白CHOP，在ROS 增多时被激活，导致细胞凋亡[24-25]。本研究结果显示，APAP 组中GRP78 和CHOP蛋白表达高于正常组，提示凋亡途径被启动。楮实子组中GRP78 和CHOP 蛋白表达低于APAP 组，提示楮实子可以拮抗内质网应激并减缓细胞凋亡的发生。

综上所述，楮实子可能通过减少ROS 含量，抑制JNK 活化，修复线粒体膜通透性，抑制内质网应激，抑制细胞凋亡，从而发挥对L02 细胞损伤的保护作用，但尚有待深入系统的研究明确其作用靶点。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。