孟鲁司特钠联合布地奈德通过p38MAPK 通路抑制哮喘炎性反应#

王一迪 朱旭阳 辛子敏 卓馨 江舟 汪宇辉 成姝婷 Δ

（1. 四川大学华西药学院，四川 成都 610041；2. 四川大学华西第二医院，四川 成都 610041；3. 四川大学华西基础医学与法医学院生物医学工程研究室，四川 成都 610041；4. 国家卫生健康委员会时间生物学重点实验室（四川大学），四川 成都 610041）

支气管哮喘（Bronchial Asthma，BA）是一种慢性炎症性呼吸系统疾病，主要症状包括呼吸急促、喘息和咳嗽，其症状随时间的推移而逐渐加重，可严重危害人类生命健康和生活质量。哮喘发病人数众多，全球哮喘患者已超过3.6 亿，具有包含全年龄段、全社会阶层和无性别差异等多种特征[1]。我国约有3000 万哮喘患者，哮喘致死率为36.7/10 万，是全球哮喘致死率最高的国家之一[2]。因此探寻哮喘有效的防治方法意义重大。

布地奈德混悬液（Budesonide suspension）属于吸入式强效糖皮质激素（Glucocorticoid，GCs)，对内皮细胞和平滑肌细胞具有显著的稳定作用，能够减轻哮喘症状，但单一给药中药效不稳定，常需要与其他药物联用[3]。而孟鲁司特钠（Montelukast Sodium）是一种白三烯受体拮抗剂（Leukotriene Receptor Antagonists，LTRA)，能够通过抑制气道炎症反应而有效减轻气道受阻现象[4]。根据目前的研究进展及临床用药经验，孟鲁司特钠与吸入式布地奈德联合给药能够明显改善患者的肺功能，并减轻其炎症反应[5-7]，即白三烯（Leukotriene，LT）和糖皮质激素联合给药可更好的改善哮喘治疗效果，但其具体机理尚不明确。已知白三烯和糖皮质激素均可影响丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路的活性[8,9]，因此我们认为，吸入式糖皮质激素与抗白三烯药物联合给药可能是通过共同于MAPK通路而增强了哮喘治疗的效果。

为验证上述假设，本实验拟通过卵清蛋白诱导法构建支气管哮喘小鼠模型，对比联合给药与两种药物单一给药后的的治疗效果，并比较各组小鼠肺组织中MAPK 信号通路的活性，为新药研发和联合给药在临床治疗中的应用提供新的参考及依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组

雄性SPF 级BALB/C 小鼠24 只，6 周龄，体质量15～20 g，购买于成都药康生物科技有限公司。所有雄鼠均饲养于12L: 12D 光暗循环环境，自由饮水进食。适应性喂养3 d 后，将小鼠按照随机数字表法分为空白组、哮喘组、哮喘+孟鲁司特钠组、哮喘+布地奈德组、哮喘+联合给药组。其中空白组和哮喘组各6 只，其余组各4 只。

1.1.2 药品与试剂

卵清蛋白（Ovalbumin，OVA）（Sigma，批号：A5503-1G）；小鼠白细胞介素5（Interleukin-5，IL-5）ELISA 科研试剂盒（江苏酶免实业有限公司）；RIPA裂解液（Servicebio，货号G2002-100ML）；蛋白Marker（Servicebio，货号G2083-250UL）；BCA 蛋白定量检测试剂盒（Servicebio，货号G2026）；β-actin 抗体、p-p38MAPK 抗体，HRP- 山羊抗兔抗体（Servicebio，货号分别：GB15003、GB113380、GB23303）；苏木精－伊红( Hematoxylin eosin，HE) 染色试剂盒、显影液（上海碧云天生物技术公司，货号分别：C0105S、C1091）、美国通用Rehydragel@LV 铝佐剂（北京博奥森生物技术有限公司）、孟鲁司特钠片（四川大冢制药有限公司）、吸入式布地奈德混悬液（正大天晴药业集团）。

1.1.3 仪器

荧光倒置显微镜（日本奥林巴斯，型号：CKX53）；医用低温保存箱（青岛海尔特种电器有限公司，型号：DW-86L490J）；高速冷冻离心机（德国艾本德，型号：5804R）；超灵敏化学发光成像仪（美国通用电气公司，型号：ImageQuant LAS 4000mini）

1.2 方法

1.2.1 过敏性哮喘小鼠模型的构建及给药

除空白组外，其余各组小鼠均按照OVA 法进行小鼠过敏性哮喘模型的建立[10]。方法如下：使用OVA与生理盐水（Normal saline，NS）配制0.8 mg·mL-1的OVA 溶液后与等体积的氢氧化铝凝胶免疫佐剂制得OVA 致敏剂，腹腔注射，1 次·7d-1，共三次（0 d、7 d、14 d），此过程是全身致敏阶段；d18 对各组小鼠使用OVA 溶液雾化30min（溶液配制：将20mg OVA溶解于10 mL NS 中），d20、d22 重复上述操作，该过程为雾化激发阶段，构建小鼠过敏性哮喘模型。

因由OVA 法所制得的过敏性哮喘小鼠模型具有较强的自愈性，故本实验采用雾化激发与分组给药同时进行的方式，于每次雾化激发的两小时后对哮喘+联合给药组和哮喘+布地奈德组给予0.125 mg·kg-1布地奈德雾化操作；空白组、哮喘组和哮喘+孟鲁司特钠组给予等量生理盐水雾化；由于孟鲁司特钠在临床中常以睡前给药的方式用药，同时小鼠是夜行动物，有着昼伏夜出的行为节律，故于雾化后一天动物房开灯前一小时对哮喘+孟鲁司特钠组和联合给药组给予1.5 mg·kg-1孟鲁司特钠药液灌胃；空白组、哮喘组和哮喘+布地奈德组予以等量生理盐水灌胃。最后一次灌胃给药结束12 h 后，进行功能及指标检测。

1.2.2 观察气道炎症

用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠后，打开小鼠胸腔，以灌注针插入心尖，剪开右心耳，先以生理盐水灌注，待到心耳处流出液体清亮后换用4%多聚甲醛继续灌注20 mL。取出小鼠肺组织放入4%多聚甲醛继续固定24 h 后，经组织脱水、透化、石蜡包埋、切片，二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化、PBS 冲洗，HE 染色后，于160 倍显微镜下观察小鼠肺组织病理学改变并作对比。

1.2.3 检测支气管肺泡灌洗液白细胞介素-5（Interleukin-5，IL-5）水平

颈椎脱臼法处死小鼠后，将小鼠仰卧位固定气管插管，取1.0 mL 生理盐水灌洗肺泡 3 次，每次灌洗反复缓慢抽吸3 遍，并记录回收量（回收率＞80%）。回收的支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid，BALF）装入EP 管中，4℃ 1500 rpm 离心15 min，吸取上清液，按照ELISA 检测试剂盒说明书测定肺泡灌洗液中IL-5 水平并对各组数据进行比较。

1.2.4 检测小鼠肺组织p38MAPK 信号通路蛋白水平

将1.2.3 中回收了BALF 的小鼠肺组织取出、剪碎，液氮碾磨成细粉状，按照 1 ∶ 5 质量与体积比加入裂解液，于冰上裂解 30 min，4℃ 12000 rpm 离心10 min 后分离上清待用。BCA 法测定上清中总蛋白浓度。以Western blot 的方法检测各组小鼠肺组织中p-p38MAPK 蛋白质水平。

1.2.5 统计学分析

实验结果数据使用SPSS 26.0 软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 病理切片HE 染色结果分析

HE 染色显示：空白组小鼠气道黏膜组织正常，见极轻微的炎性细胞浸润，见图1A；哮喘组小鼠小鼠气道黏膜组织明显增厚，且出现明显的炎性细胞浸润，显示造模成功，见图1B；哮喘+孟鲁司特钠组与哮喘+布地奈德组在HE 染色的结果观察上无明显差异，小鼠气道均出现黏膜组织组织增厚和炎性细胞浸润的现象但介于空白组与哮喘组之间，见图1C 和1D；哮喘+联合给药组小鼠气道亦出现黏膜组织增厚和炎性浸润的现象但增厚程度与浸润程度均明显低于两单一给药组，见图1E。

图1 各组小鼠气道组织的形态学变化（HE，160×）

图2 各组小鼠肺泡灌洗液IL-5 水平的比较（，n=3）

图3 p38 MAPK 通路蛋白在各组小鼠肺组织中的表达（，n=3）

2.2 各组小鼠肺泡灌洗液IL-5 水平比较

与空白组相比，哮喘组小鼠肺泡灌洗液IL-5 水平明显升高（P＜0.05），哮喘+联合给药组小鼠肺泡灌洗液IL-5 水平明显降低（P＜0.05）。与哮喘组相比，哮喘+孟鲁司特钠组、哮喘+布地奈德组、哮喘+联合给药组小鼠肺泡灌洗液IL-5 水平均明显降低（P＜0.05）；而与哮喘+孟鲁司特钠组和哮喘+布地奈德组相比，哮喘+联合给药组小鼠肺泡灌洗液IL-5 水平明显降低（P＜0.05）。

2.3 各组小鼠肺组织p-p38MAPK 通路蛋白表达

与哮喘组相比，哮喘+孟鲁司特钠组、哮喘+布地奈德组、哮喘+联合给药组小鼠肺组织中p-p38MAPK水平均明显降低（P＜0.05)。

与哮喘+孟鲁司特钠组相比，哮喘+联合给药组小鼠肺组织中p-p38MAPK 的水平明显降低（P＜0.05)；但与哮喘+布地奈德组相比，哮喘+联合给药组小鼠肺组织中的p-p38MAPK 蛋白水平虽有降低，但无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

支气管哮喘是一种在全球范围内广泛威胁人类健康的慢性呼吸系统疾病，具有多种治疗的方向，其中临床上广泛采用吸入式布地奈德与孟鲁司特钠联合给药的方式进行治疗，且在临床结果上证明其具有很好的治疗效果[11]，但其治疗机理尚不明确。为此，本研究首先通过对各组小鼠进行OVA 法哮喘建模和分组给药，结果显示，与空白组相比哮喘组小鼠气道黏膜组织明显增厚，且出现明显的炎性细胞浸润，显示造模成功。

与哮喘组相比，各给药组小鼠气道黏膜组织均出现不同程度的增厚且出现炎性细胞浸润现象但程度均较轻，同时哮喘+联合给药组小鼠气道增厚程度和炎性细胞浸润程度最低。该结果初步表明吸入式布地奈德与孟鲁司特钠联合给药对哮喘具有明显的疗效上的优势，但有关其作用机制尚不明确。

支气管哮喘作为一种由多种细胞和细胞组分参与的气道慢性炎症为特征的异质性疾病，与气道高反应性密切相关。其中嗜酸细胞的趋化是哮喘气道炎性反应的关键环节，而IL-5 能够促使嗜酸细胞向气道炎性区域处迁移并诱导B 细胞产生IgE 抗体引发炎性效应[12]，因而肺泡灌洗液中IL-5 的水平与炎性效应的严重程度密切相关。本研究检测结果显示，与哮喘组、哮喘+孟鲁司特钠组、哮喘+布地奈德组相比，哮喘+联合给药组小鼠肺泡灌洗液中IL-5 水平存在明显的下降趋势，炎性效应明显减轻。本研究结果显示，孟鲁司特钠+吸入式布地奈德联合给药途径能够明显降低哮喘肺泡灌洗液中IL-5 水平从而缓解小鼠疾病状态，提示联合给药能够通过抑制p38MAPK 通路进而抑制白细胞系分泌IL-5[13]，从而减轻哮喘炎性效应起到治疗哮喘的作用。

对于本实验中空白组小鼠肺泡灌洗液中IL-5 水平明显低于哮喘+联合给药组的现象（P＜0.05），结合HE 染色结果中空白组小鼠气道也出现了部分黏膜组织增厚和炎性浸润现象，我们认为空白组小鼠由于实验过程中的腹腔注射、灌胃、生理盐水雾化以及日常饲养的过程中存在出现炎症反应的现象[14]，且联合给药的抑制炎性反应的效果十分明显，故会出现哮喘+联合给药组肺泡灌洗液IL-5 水平平均值低于空白组的现象。p38 途径是MAPK 家族中的一个重要组成部分，其中p38δ主要在肺、肾、肠、唾液腺的表皮细胞及睾丸、卵巢、肾上腺和垂体表达，其与组织炎症反应有密切地联系[15]。既往研究表明，p38MAPK 通路能够抑制哮喘的气道炎症[16]。并且p38MAPK 信号通路能够在受到刺激的时候以磷酸化的方式激活，进而广泛地参与到例如调控炎性反应的多种生物学效应中[17]。本研究检测结果显示，与哮喘+孟鲁司特钠组和哮喘+布地奈德组相比，哮喘+联合给药组小鼠肺组织中p-p38MAPK 的水平有降低的趋势。本研究结果表明，孟鲁司特钠+吸入式布地奈德联合给药能够通过抑制p38MAPK 磷酸化激活来降低哮喘炎性反应从而减轻哮喘症状。

综上所述，本研究通过探究孟鲁司特钠+吸入式布地奈德联合给药对于哮喘模型小鼠炎性反应的作用发现，联合给药能够有效改善哮喘的炎性反应的发生及发展，其机制可能与抑制体内p38MAPK 磷酸化激活有关。以上研究结果初步揭示了孟鲁司特钠+吸入式布地奈德联合给药对于哮喘的治疗机制，为哮喘治疗方法的优化以及新药研发提供了可能的思路。但本研究也存在一定的局限性，未能从细胞层面对研究结果进行进一步论证。为此，本研究计划在未来通过体外培养支气管上皮细胞进一步明确孟鲁司特钠+吸入式布地奈德联合给药对于哮喘的治疗机制，以期为哮喘临床治疗方法及新药研发提供新的思路。