红景天苷对类风湿关节炎小鼠缺氧及炎性反应的作用机制

张文广,李 琴,星 媛

(青海省中医院风湿科,青海 西宁 810001)

类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)属于中医学“痹证”范畴,以邪气痹阻经脉而致气血亏虚、肝肾不足、筋骨失养为主要病机[1]。《临证指南医案》中对于“痹证”的阐述提示瘀血与痰浊互结贯穿RA整个病程,因此通过治瘀能够控制RA病情发展[2]。中医实施个体化的辨证论治,已运用多种重要有效成分和复方汤剂治疗RA并在阻止病情发展上取得较大优势。雷公藤、姜黄素等有效成分已被作为RA治疗的重要药物[3-4]。复方汤剂中生地苦参汤可以协同艾拉莫德缓解RA患者的炎性症状,桂枝芍药知母汤能够有效改善RA患者关节肿痛,均表现出中医治疗RA的安全性和有效性[5-6]。

红景天苷是从药用植物红景天中提取出的有效药物成分,具有补肾、行气养血、扶正固本的疗效,而且红景天苷抗肿瘤、抗疲劳、均衡调节中枢神经、抗应激、抗缺氧功效较好[7]。本研究旨在通过RA模型小鼠探究红景天苷缓解RA炎症的分子机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物基本情况与饲养条件:40只C57BL/6雄性小鼠6～8周龄,体重20～24 g,平均(22±2)g,购自青海生物药品厂有限公司,许可证号SYXK(青)2023-0002。所有小鼠均在无病原菌的干净笼子中喂养,笼内添加垫料,给予充足饲料和饮水,保证小鼠能够自由走动与摄食,所有饮用水和食物均进行了高压灭菌。饲养环境温度20～25 ℃、湿度(55±5)%,12 h昼夜循环照明,适应性饲养1周。

1.1.2 主要实验试剂:红景天苷(货号10338-51-9),弗氏完全佐剂(货号7009),弗氏不完全佐剂(货号7002),TRIzol(货号15596-026),cDNA合成试剂盒(货号6110A),定量PCR反转录试剂(货号RR036Q)。肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)ELISA检测试剂盒(货号MTA00B),白介素-6(Interleukin-6,IL-6)ELISA检测试剂盒(货号M6000B),苏木素伊红染液(货号C0105S),蛋白酶抑制剂PMSF(货号ST505),蛋白质裂解液RIPA(货号P0013B),BCA试剂盒(货号P0009)。

1.2 实验方法

1.2.1 建模方法与评价:构建胶原蛋白诱导的关节炎(Collagen-induced arthritis,CIA)模型小鼠。2 mg/ml牛Ⅱ型胶原5 ml与等体积的弗氏完全佐剂混合后反复抽吸乳化,向小鼠尾基部皮内注射200 μl弗氏完全佐剂乳化的牛Ⅱ型胶原进行免疫后,在第21天于尾基部另一部位皮内注射200 μl弗氏不完全佐剂乳化的牛Ⅱ型胶原加强免疫。按照文献描述[8]对小鼠关节炎进行评分分级,最高等级为16分。基本标准设定为每只爪子从0～4分表示关节炎严重程度:0分为正常关节;1分为轻微肿胀或拇指红斑;2分为脚部皮肤发红,轻微肿胀;3分为中度肿胀和红斑;4分为累及整个后爪或全身的严重肿胀和红斑。将评分超过6分的小鼠判定为造模成功。

1.2.2 分组方法与给药:随机抽取10只仅正常摄食饮水而不做任何处理的小鼠作为空白组。30只CIA模型构建成功的小鼠被随机分成模型组、对照组、实验组,各组10只。模型组不进行药物注射仅正常摄食饮水;对照组以5 g/(kg·d)的0.9%氯化钠溶液灌胃;将25 mg红景天苷粉末溶解于无菌PBS中配制成5 mg/ml工作液,实验组使用红景天苷工作液以5 g/(kg·d)剂量胃内给药。各组小鼠在第一次免疫后第70天用戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔注射,进行安乐死,从小鼠身上收集膝关节滑膜组织。

1.2.3 RNA提取和实时荧光定量PCR(RT-qPCR):将小鼠膝关节滑膜组织在研钵中碾碎,用TRIzol提取小鼠滑膜组织总RNA。按照cDNA合成试剂盒的说明进行逆转录,之后使用引物和定量PCR反转录试剂盒进行RT-qPCR,GAPDH作为内参。引物序列见表1。

表1 各基因引物序列

1.2.4 HE染色:将从小鼠关节处分离的滑膜组织固定于4%多聚甲醛后包埋于石蜡中,通过石蜡切片机切成厚度为4 μm的均匀切片。将石蜡切片放在60 ℃烤箱中加热1 h,依次放入二甲苯Ⅰ5 min、二甲苯Ⅱ 5 min、无水乙醇Ⅰ5 min、无水乙醇Ⅱ 5 min、95%酒精5 min、75%酒精5 min中进行脱蜡处理,再用蒸馏水洗涤。用苏木素染液浸染8 min,蒸馏水冲洗,加1%的盐酸酒精分化数秒后,蒸馏水冲洗,0.6%氨水返蓝,流动清水下冲洗。再将切片放入伊红染液中染色3 min,蒸馏水冲洗后依次放入95%乙醇Ⅰ 5 min、95%酒精Ⅱ 5 min、无水乙醇Ⅰ 5 min、无水乙醇Ⅱ 5 min、二甲苯Ⅰ 5 min、二甲苯Ⅱ 5 min中脱水至透明,切片晾干后用中性树胶封片。

1.2.5 组织病理学评分[9]:用光学显微镜观察HE染色后病理切片,从滑膜细胞增殖、炎症细胞浸润和血管翳形成进行分项评分,分值越高表示损伤越严重。滑膜细胞增殖评分标准:0分表示无增殖;1分表示2～4层滑膜细胞,轻微增殖;2分表示4层以上滑膜细胞,中度增殖;3分表示滑膜细胞过度增殖,侵蚀软骨和骨。炎症细胞浸润评分标准:0分表示正常;1分可见少数分散的白细胞浸润;2分可见2个或2个以上白细胞聚集;3分可见白细胞融合,分散浸润明显。血管翳形成的评分标准:0分无血管翳形成;1分有2个部位出现血管翳;2分有4个部位出现血管翳;3分有4个以上部位出现血管翳。

1.2.6 酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA):将小鼠膝关节滑膜组织在研钵中碾碎后,使用含有PMSF的蛋白裂解液RIPA进行蛋白质提取,用BCA试剂盒测定蛋白浓度。根据试剂盒制造商的说明,通过ELISA检测小鼠滑膜组织中TNF-α、IL-6的含量。

2 结 果

2.1 各组CIA小鼠关节炎评分比较 见表2。模型组CIA小鼠关节炎评分均高于空白组,差异有统计学意义(均P<0.05)。对照组与模型组的关节炎评分比较,差异无统计学意义(P>0.05)。实验组小鼠在红景天苷治疗10 d后关节炎评分开始下降,治疗30 d后关节炎评分表现出显著的下降趋势,实验组各时间点的关节炎评分均低于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。

表2 各组CIA小鼠关节炎评分比较(分)

2.2 各组关节炎小鼠滑膜组织病理变化比较 见表3。通过HE染色对小鼠滑膜组织进行病理学评分,类风湿性关节炎小鼠滑膜组织存在明显的滑膜细胞增殖、炎症细胞浸润、血管翳形成等病理表现。从各组评分情况来看,模型组小鼠滑膜组织病理学各项评分均高于空白组小鼠的评分,差异有统计学意义(P<0.01)。模型组相比,实验组小鼠在红景天苷治疗后,滑膜增生、炎症细胞浸润、血管翳形成均得到改善,实验组各项评分均低于对照组、模型组,差异有统计学意义(P<0.01)。

表3 各组CIA小鼠滑膜组织病理改变程度评分(分)

2.3 各组关节炎小鼠促炎因子比较 见表4。通过ELISA测定滑膜组织中促炎因子TNF-α、IL-6表达。与空白组比较,模型组、对照组、实验组CIA模型小鼠滑膜组织中促炎因子TNF-α、IL-6的水平均高于空白组,差异有统计学意义(P<0.05)。模型组CIA模型小鼠滑膜组织中促炎因子TNF-α、IL-6的水平高于对照组、实验组,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组小鼠通过红景天苷干预后抑制了TNF-α、IL-6的过度产生,实验组TNF-α、IL-6水平均低于对照组、模型组,差异有统计学意义(P<0.01)。

表4 各组小鼠滑膜组织中炎症因子水平比较

2.4 各组CIA小鼠缺氧状态比较 见表5。RA滑膜组织中的病理特征是缺氧。缺氧诱导因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)和核因子E2相关因子2(Nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)是缺氧适应反应中的主要调节因子。通过RT-qPCR检测CIA小鼠缺氧情况,见表5。CIA小鼠滑膜组织中HIF-1α mRNA显著上调,Nrf2 mRNA则降低,表明造模后小鼠滑膜组织存在缺氧状态。实验组小鼠在红景天苷干预后HIF-1α mRNA降低而Nrf2 mRNA升高,且与对照组、模型组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。

表5 各组CIA小鼠缺氧相关因子mRNA比较

2.5 各组CIA小鼠PHD2、PP2A、MAPK的mRNA比较 见表6。CIA小鼠模型中PHD2、PP2A和MAPK的mRNA水平显著上调,模型组与空白组比较,差异有统计学意义(P<0.01),表明RA诱导小鼠滑膜组织中PHD2/PP2A/MAPK信号的过度激活。实验组小鼠在红景天苷干预后滑膜组织中PHD2、PP2A、MAPK的mRNA水平均降低,且与模型组、对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。

表6 各组CIA小鼠PHD2、PP2A、MAPK的mRNA比较

3 讨 论

类风湿性关节炎作为病因不明的慢性侵袭性自身免疫性疾病,基本病理变化为关节滑膜的慢性炎症、血管翳形成[10]。全身炎症反应导致的疼痛、关节肿胀和僵硬则大大降低患者生活质量,由于目前缺乏治愈方案,缓解症状是治疗RA的首要任务,因此减轻临床症状且耐受性较好的治疗方案至关重要。

滑膜成纤维细胞(Fibroblast-like synoviocytes,FLS)增殖和新生血管生成是RA病情发展的重要环节。缺氧是RA滑膜炎症发展的重要因素。有研究表明,由于缺氧诱导HIF-1α在滑膜组织中高表达,有助于滑膜中炎症基因表达和细胞存活[11-12]。鉴于缺氧环境下RA关节滑膜中浸润的免疫细胞会上调HIF-1α并诱导活性氧(Reactive oxygen species,ROS)生成而加剧滑膜炎症,因此氧化应激药物有助于缓解RA炎性症状[13]。红景天为多年生草本植物,主要生长在高海拔的严寒、缺氧、昼夜温差大地区,红景天苷为其主要有效成分[14]。多项研究证明,减轻缺氧诱导的疾病症状可通过抑制氧化应激实现,如应用于糖尿病大鼠视网膜病变的治疗[15-16]。氧化应激药物通过调节HIF-1α相关信号,抑制胆囊癌细胞增殖[17]。氧化应激药物通过PI3K、HIF-1途径保护急性缺氧性神经细胞免受损伤[18-19]。本研究结果证实,红景天苷能有效缓解CIA模型小鼠的缺氧状态,缓解RA滑膜组织增生、血管再生和炎性症状。

RA的疾病进程不外乎因痰瘀致虚,痰瘀胶着关节,闭阻经络,中医辨证认为需以化痰通络、祛除风寒湿邪为主要治疗目的[20]。血瘀而致气虚,在某种程度上可认为是滑膜微血管中氧灌注量减少的表现,免疫炎症细胞代偿性激活炎症信号以实现适应性生存,导致滑膜的炎性侵袭及代谢减弱。红景天苷因抗缺氧功效和抗炎功能发挥通经舒络、活血益气功效,是缓解RA症状的有效药物。

本实验构建了胶原蛋白诱导的RA小鼠模型,通过对比模型组和空白组的关节炎评分差异,确定胶原诱导的CIA模型构建成功。再用红景天苷对CIA模型小鼠进行治疗,通过关节炎评分差异证明红景天对缓解CIA小鼠关节炎症状有明显改善效果。滑膜血管翳形成是RA的核心病理变化,血管新生是产生血管翳的必要条件,内皮细胞的增殖和游走形成新的血管,在RA的早期,炎症细胞向关节腔迁移和侵袭,滑膜绒毛增生并伴随着新生血管的形成滑膜增生和炎症造成关节腔内缺氧状态,致使HIF-1α激活。接着通过HE染色对比红景天苷治疗与否的CIA小鼠滑膜组织的病理程度改变,结果显示红景天苷能显著减轻CIA小鼠滑膜组织中细胞增殖、炎症细胞浸润、血管翳形成,通过ELISA验证了红景天苷治疗能显著降低滑膜组织中促炎因子TNF-α、IL-6的表达,进一步实验结果证实红景天苷能下调HIF-1α水平,表现为有效缓解CIA模型小鼠的缺氧状态。因此红景天苷通过缓解RA滑膜组织增生、血管再生、炎性症状和改善缺氧达到治疗RA的作用。滑膜组织中FLS缺氧是RA疾病进展的重要因素,缺氧诱导的HIF-1α信号通路上调对于疾病发展起着重要调节作用,因此以HIF-1α信号为靶点的药物对RA症状有明显改善效果。本研究结果表明,红景天对HIF-1αmRNA水平有显著抑制作用,于是之后对其中的分子机制进行探究。

脯氨酰羟化酶结构域蛋白(Prolyl hydroxylase domain proteins,PHD)是利用氧靶向HIF-1、HIF-2的α亚基进行蛋白酶体降解的酶,缺氧诱导PHD活性下降从而实现HIF蛋白稳定性,启动包括血管生成、ROS清除等适应性反应[21]。已有证据表明,PHD2活化是由蛋白磷酸酶2A(Protein phosphatase 2A,PP2A)介导,在血管生成中发挥重要作用[22]。PP2A在细胞凋亡、增殖等多种细胞过程中具有调节作用,涉及的途径包括抑制MAPK途径调节足细胞的上皮-间充质转化、PP2A可以与MAPK相互作用调节促进心脏干细胞迁移[23-24]。红景天苷可提高高原环境下机体的血氧饱和度,增强机体对高原低氧环境的耐受能力,并可抑制氧化应激,调节PHD2/HIF-1α水平[25]。本研究测定了红景天苷干预后CIA模型小鼠HIF-1α水平变化,结果显示HIF-1α降低,说明红景天苷对缺氧的改善效果较好。基于PHD2对HIF-1α转录调控[26],本研究进一步验证了红景天苷对PHD2/PP2A/MAPK信号通路的抑制作用,且通过体内研究数据结果表明,部分通过PHD2/PP2A/MAPK信号通路调节。

综上所述,红景天苷在缓解CIA模型小鼠关节炎症和滑膜组织增生中效果较好,其中的分子涉及PHD2/PP2A/MAPK信号通路调节。本研究尚未明确红景天苷抑制PHD2/PP2A/MAPK信号通路的具体分子机制以及对缺氧相关因子的调控是否为通路;红景天苷是否可以通过其他信号缓解RA炎性症状、改善缺氧状态,这些都需要进一步研究。