丹参-川芎药对干预大鼠血管性痴呆作用机制

陈应奇,刘英莲,梁 薇,姜子祥,韦 祎,李宏英,马天鹏,姜 燕

(1.海南医学院,海南 海口571199;2.宁波市镇海区中医医院,浙江 宁波 315000)

血管性痴呆(Vascular dementia,VD)是由脑血管疾病(Cerebrovascular disease,CVD)所致,核心表现为大脑认知功能损伤的慢性进行性疾病[1]。相关临床调查证实,VD的患病率已占全球中老年痴呆症患者的20%～30%,并被列为“痴呆”的第二大类型,以意识功能受损为主,并伴有注意力、记忆力及执行力减退等症状。近年来,人口老龄化趋势已是全世界面临的共同问题,相应地心脑血管疾病和VD发病例数也随之上升[2]。现代科研结果表明,在学习记忆的信息产生与贮存方面,海马神经元所含神经细胞Ca2+、钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(Calmodulin dependent protein kinase Ⅱ,CaMPKⅡ)、钙调蛋白(Calmodulin,CaM)发挥着重要作用[3]。丹参-川芎这一药对作为活血化瘀方中最常用组合,临床上有许多关于活血化瘀的药方或中成药,但关于丹参-川芎药对治疗海马神经细胞的作用研究鲜见报道。本实验通过干预大鼠的学习能力,并检测干预前后大鼠海马 CaM、CaMPK Ⅱ的 mRNA 水平,探讨丹参-川芎提取物对血管性痴呆认知功能的部分调控机制,为中医药诊治 VD 提供实验证据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物:选取100只SPF级SD雄性大鼠,平均体重(250±20)g ,饲养在白昼循环模式采光,室温为22 ℃左右。每日按时喂食、自由饮水,预养2周。

1.1.2 实验药物:尼莫地平片(国药准字H13021882)、硝普钠(国药准字H20058958)、庆大霉素(国药准字H42022058)。

1.1.3 实验仪器:Morris 水迷宫(中国医学科学院药物研究所提供);电子分析天平(型号XPR226DRQ/AC);离心机(型号KH22,湖南凯达科学仪器有限公司);匀浆机(型号PRO200,FLUKO 公司);酶标仪(型号LD-96A,莱恩德智能科技);激光扫描共焦显微镜(型号STELLARIS)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组方法:雄性、健康的100只SD大鼠经由随机方式归入造模组(n=80)、正常组(n=10)、假手术组(n=10)。造模组先通过Morris水迷宫找出造模有效的50只血管性痴呆大鼠,再经由随机手段归入模型组(n=10)、尼莫地平组(n=10)、丹参-川芎高剂量组(n=10)、丹参-川芎中剂量组(n=10)、丹参-川芎低剂量组(n=10)。

1.2.2 造模:先对实验动物行2周预养,自第15天起造模。造模方法为反复夹闭颈动脉,再注射硝普钠降压及单侧永久性结扎颈动脉,实验动物术前禁食、水[4]。呈仰卧位固定,按400 mg/kg用量予腹腔注射10%水合氯醛行麻醉处理,通过碘伏对颈部行常规消毒处理,颈正中切开,对组织行钝性分离,暴露两侧颈总动脉(Common carotid artery,CCA)、颈内动脉(Internal carotid,ICA)、颈外动脉(External carotid artery,ECA)。于夹闭两侧CCA前,先腹腔注入2.0 mg/kg硝普钠,借助无创动脉夹对两侧CCA行10 min夹闭操作,再将动脉夹去掉,通血10 min[5]。间歇阻断双侧颈动脉血3次后,用镊子随后将一侧颈总动脉挑起,血管下穿两根缝合线,结扎一侧颈总动脉,切口处滴注青霉素后缝合皮肤,碘伏消毒缝合处,保温饲养。假手术组只需对两侧颈动脉行分离操作,为了防范感染,术毕肌注庆大霉素。

1.2.3 模型筛选:通过Morris水迷宫完成对痴呆鼠的筛选。水池为120 cm直径,水深30 cm左右,平台为10 cm直径(相较水面偏低2 cm左右)。将池壁等分为四个象限,各象限池壁中点就是各象限的入水点,平台固定于某一象限内距离池壁约30 cm的位置。单独测试每只实验动物[6]。在测试环节对每只动物分别自4个象限入水点1次。观察记录大鼠从入水寻找并爬上平台所需的时间(这个时间被称为逃避潜伏期;并让其在平台上休息1 min后再进行下次测试,如果超过90 s未能找到平台,将其引导到平台,该逃避潜伏期记录为90 s。分别记录每只大鼠4次入水到找到平台所需时间,取4次的平均值为该鼠每天的逃避潜伏期。建模后经过2周(手术伤口已彻底愈合)开始训练大鼠,1次/d,合计5 d。把第5天正常组实验动物逃避潜伏期的均值当作参考值,对各造模动物第5天的逃避潜伏期均值与参考值的差值与参考值做比值,若此值在20%以上,表示建模有效[6]。

1.2.4 干预方法:待有效完成模型筛选工作,对各组动物开始实施相应操作,1次/d,6次/周,共处理4 周,药物人常用剂量为丹参、川芎各10 g,按照体表面积转换动物药物用量,于每日早晨 8:00 灌胃。丹参-川芎高剂量组40 mg/kg、丹参-川芎中剂量组20 mg/kg、丹参-川芎低剂量组10 mg/kg、尼莫地平组20 mg/kg干预;正常组、假手术组、模型组皆给予相应药物溶剂等量的0.9%氯化钠溶液干预;各组给药频率为1次/d、6次/周,共干预4周。

1.2.5 行为学检测:在造模前1周、造模后1周及进行相应干预措施结束后1周,各组大鼠均采取水迷宫测试,定位航行试验记录大鼠逃避潜伏期,空间探索试验记录在撤出平台后大鼠穿越原平台象限的次数。各组间数据分为定位航行试验、空间探索试验两大项,以此对各组大鼠的学习记忆功能变化进行评价。

1.2.6 实验室指标检测:腹主动脉引出尽可能多的血液后,断头处死实验动物,同时快速将其脑组织取出,通过冰冷0.9%氯化钠溶液将残留血液除掉,随后分离出海马组织,称重后装入冻存管中迅速置于液氮,保存备用待检测。激光扫描,共焦显微镜观察海马神经细胞[Ca2+] i。各组分别选择 5 只动物两侧海马组织,通过冷胰蛋白酶(Trypsin)消化法完成对神经细胞的分离,借助微量加样器将1 μl荧光探针 Fluo-3滴加于在盖玻片上贴壁的海马神经细胞悬浮液。观察工具为激光扫描共焦显微镜,反射光、激发光各设定为530、488 nm,对各视野神经细胞实施激光扫描查看细胞中[Ca2+]i,并对细胞中荧光像素的相对值记录。

1.2.7 RT-qPCR 半定量检测 mRNA 表达:快速分离各组大鼠海马,液氮中保存。用总 RNA 抽提试剂(Trizol 试剂)提取总RNA 后,反转录合成 cDNA 第一链,并将其当作模板,各自对 CaM、CaMPKⅡ受损PCR 扩增处理,内参为β-actin 。引物信息见表1。

表1 各基因引物信息

2 结 果

2.1 各组大鼠干预前定位航行试验比较 见表2。干预前,各组大鼠前3 d的训练情况比较均无差异,组间因素与正常训练天数之间没有交互作用。第 4天起,正常组与造模组开始不同,差异有统计学意义(P<0.05)。干预前第4、5天,各给药组间大鼠定位航行试验比较,差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 各组大鼠干预前不同时间定位航行试验比较(s)

2.2 各组大鼠干预后定位航行试验比较 见表3。各组大鼠在接受干预后第1天,正常组与其他各组定位航行试验比较,差异无统计学意义(P>0.05)。干预第 2天,正常组与其他各组定位航行试验比较,差异有统计学意义(P<0.01)。干预第5天,丹参-川芎高剂量组与尼莫地平组定位航行试验比较,差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 各组大鼠干预后不同时间点定位航行试验比较(s)

2.3 各组大鼠干预前后空间探索试验比较 见表4。干预后,正常组、假手术组、模型组、尼莫地平组、丹参-川芎高剂量组、丹参-川芎中剂量组、丹参-川芎低剂量组的空间探索试验结果均高于干预前。干预后,尼莫地平组、丹参-川芎高剂量组、丹参-川芎中剂量组、丹参-川芎低剂量组空间探索试验结果均低于正常组和假手术组。丹参-川芎高剂量的空间探索试验结果与尼莫地平组比较,差异无统计学意义(P>0.05),而丹参-川芎高剂量组高于丹参-川芎低剂量组,差异有统计学意义(P<0.01)。

表4 各组大鼠干预前后空间探索试验比较(次)

2.4 各组大鼠干预后 [Ca2+]i荧光像素相对值比较 见表5。模型组的[Ca2+]i荧光像素相对值高于正常组,差异有统计学意义(P<0.01)。干预后,接收药物干预的各组[Ca2+]i荧光像素相对值低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。干预后,丹参-川芎高剂量组[Ca2+]i荧光像素相对值与尼莫地平组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。丹参-川芎高剂量组[Ca2+]i荧光像素相对值低于丹参-川芎中剂量组、丹参-川芎低剂量组,差异有统计学意义(P<0.05)。

表5 各组大鼠干预后[Ca2+]i荧光像素相对值比较

2.5 各组大鼠干预后海马神经细胞CaM、CaMPKⅡ的mRNA表达比较 见表6。干预后,模型组CaM、CaMPKⅡ的mRNA含量低于正常组,差异有统计学意义(P<0.01)。干预后,丹参-川芎高剂量组CaM、CaMPKⅡ的mRNA含量高于尼莫地平组、丹参-川芎中剂量组、丹参-川芎低剂量组,差异有统计学意义(P<0.05)。

表6 各组大鼠干预后海马神经细胞CaM、CaMPKⅡ的 mRNA 表达比较

3 讨 论

VD为现代医学的命名,在中医学文献中与之匹配的病型归属于“呆病”范畴,其主要表现为健忘,病机与“瘀”相关,历代医学典籍中散在提及此类疾病[7]。“年五十以上,阳气日衰……心力渐退,忘前失后”[8]。《杂病源流犀烛》中提到的“中风后,善忘”等[9]。首次对“呆病”提出专论是明代《景岳全书·杂证谟》,而清代陈士铎《辨证录》单独提出“呆病门”,对呆病症状详细描述,并阐明成因、病机、病理转化过程,其主要与脑相关;而脑又被称为髓海,血能滋养脑髓,是将精微上供于脑髓的主要载体[10]。血液的正常运行与脏腑功能、气机运转、脉道通利等机体内外环境因素关系密切。凡是能促使血液运行不畅或离开经脉的各种因素,导致瘀血的形成。现代研究证实,血瘀证和脑灌注异常、血液流变学异常、血流动力学、微循环受限等存在紧密联系,VD患者有不同程度的血液流变学异常表现,如聚、浓、凝、黏等[11]。ASL-MRI、CTA、TCD等脑血管相关检查发现,相当数量的VD患者存在血管动脉粥样硬化、血管狭窄、血管闭塞、血管瘤、先天血管异常、血液灌注不足等[12]。心脏附壁血栓、原发性血管炎、免疫性血管疾病、动脉粥样硬化斑块引起脑栓塞等脑血管病亦与中医血瘀证相关[13]。

中药在治疗痴呆方面有一定优势,中药治疗呆病历史悠久,古代医家留下很多治疗痴呆的宝贵经验[14]。我国地势复杂,中草药类型多样。研究发现,活血化瘀药物如丹参、川芎、葛根、鸡血藤等具有改善血液流变学,增加脑血流作用[15]。《日华子本草》记载川芎具有“破症结宿血,养新血……,及排脓消瘀血”的作用,《本草纲目》记载丹参有“活血,通心包络”功效,在治疗瘀血内阻型老年痴呆中丹参的运用尤为重要[16-17]。川芎与丹参同用,可助川芎活血行气祛瘀之力,川芎、丹参相配既可入血分又可入气分,气随血行,从而活血化瘀,让滞留于脑府脉络的瘀血消散,是治疗痴呆常用的活血化瘀药对。现代药理学对川芎、丹参单味药有研究,川芎水提物中与抗血小板聚集活性的关系最为密切,可改善脑循环;丹参中的丹参酮具有抗凝血作用,有利于增加脑局部血液供应,防止血栓和动脉粥样硬化形成,这可能与其抗炎、抗氧化、下调血脂等调节机制激活相关[18-19]。“丹参-川芎”药对的作用靶点分布在多种细胞组分中,主要以胞质为主,通过多种结合方式参与生物进程,有抗小动脉硬化、抗血小板聚集、预防血栓的形成作用,且能改善脑血管微循环[20]。

现代研究结果表明,对于学习与记忆的形成与维持,海马神经元细胞功能与形态发挥着核心作用。正常情况下,钙离子在细胞内可作为第二信使C与aM结合生成复合物,但 CaMPKⅡ是处于静止状态[21]。当细胞受外界刺激时,CaMPKⅡ会被激活,然后与复合物结合形成新复合物,使细胞内的钙离子水平又恢复到基础状态。同时 CaMPK Ⅱ快速出现自身磷酸化,对Ca2+失去依赖性,此自身磷酸化能够使CaMPK Ⅱ留存先前活化Ca2+信号,这与记忆产生与存储相关[22-23]。

本实验结果显示,干预前在熟悉环境并获取空间信息后各组大鼠表现记忆方面的能力存在差异,造模各组大鼠在寻找平台的效率上开始落后于正常组,VD大鼠的空间参考记忆力明显受损。干预后,各治疗组大鼠在寻找及穿越平台的效率明显优于模型组,丹参-川芎高剂量组与尼莫地平组无差异,接近正常组。模型组[Ca2+]i含量明显增高,而CaM、CaMPKⅡ的mRNA表达量减少;各治疗组Ca2+的含量明显减少,CaM、CaMPKⅡ mRNA表达量明显增多,丹参-川芎高剂量组与尼莫地平组Ca2+的含量相当,均低于丹参-川芎中剂量组、丹参-川芎低剂量组;丹参-川芎高剂量组与尼莫地平组CaM、CaMPKⅡ的mRNA含量增多,且均高于丹参-川芎中剂量组、丹参-川芎低剂量组。实验表明,脑部缺血、缺氧后导致钙离子通道异常,海马组织的神经细胞[Ca2+]i会增多,使得Ca2+在细胞内大量聚积,Ca2+过量可减弱腺苷酸环化酶(Adenylate cyclase,AC)功能,并将磷酸二酯酶(Phosphodiesterase,PDE)活化,从而使cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response-element protein,CREB)的生成量下降,细胞中cAMP浓度减少[24]。cAMP水平降低,减少蛋白激酶A(Protein kinase A,PKA)激活,使cAMP磷酸化受到严重抑制,对CRE转录启动下游基因活动不利[17]。然而,CRE 的启动障碍降低了CaM,CaMPKⅡ的mRNA 转录水平[25]。丹参-川芎药对能有效抑制其表达,证明丹参-川芎药对通过降低海马细胞内[Ca2+]i荧光强度作用机制,控制CaM、CaMPK Ⅱ的mRNA表达量。实验结果显示,丹参-川芎药对成功阻止了VD大鼠海马神经细胞[Ca2+]i过量增加和CaM、CaMPKⅡ的mRNA 表达下降,且对于 VD 大鼠临床症状也能有效改善,为临床深入研究丹参-川芎治疗 AD 作用机制提供参考。