辛芷通窍颗粒对慢性鼻窦炎小鼠鼻窦黏膜的保护机制研究

李群真,李 军,郭树繁,燕 茹,董学娜,马凤梅

(河北省中医院耳鼻喉科,河北 石家庄 050011)

慢性鼻窦炎(Chronic rhinosinusitis,CRS)是一种常见的上呼吸道疾病,主要特征是鼻窦黏膜的慢性炎症和黏液分泌增加。CRS严重影响患者生活质量,给社会和经济带来了巨大负担。CRS的治疗措施主要包括抗生素、抗炎药物和手术等[1]。在目前的研究中,对CRS的病理生理机制已有一定了解,但仍存在一些局限性。首先,传统的治疗方法主要针对炎症反应和黏液过度分泌进行干预,缺乏对疾病发生发展机制的全面认识。其次,现有的治疗方法往往只能缓解症状,无法从根本上改变疾病进程[2]。因此,有必要寻找新的治疗方法,深入研究慢性鼻窦炎的发病机制,提高治疗效果。辛芷通窍颗粒作为一种传统中药方剂,由辛夷、苍耳子、白芷、薄荷、麻黄、金银花、黄芩、石膏、鱼腥草、川芎、陈皮、甘草等组成,具有疏风通窍、清热解毒功效,主要用于治疗过敏性鼻炎[3]。有临床研究表明,辛芷通窍颗粒可显著改善CRS患者症状,减轻炎症反应,提高生活质量,但具体机制尚不清楚[4-5]。因此,本研究旨在探讨辛芷通窍颗粒对CRS小鼠鼻窦黏膜的保护作用及机制,以期为辛芷通窍颗粒的科学应用提供更多依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物:50只6～8周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠,平均体重(22±2)g,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司[实验动物生产许可证号SCXK(沪)2008-0016]。遵循实验动物的3R原则,所有小鼠均在相对湿度70%,环境温度(24±2)℃,12 h明暗交替条件下喂养。

1.1.2 主要试剂:BCA蛋白定量试剂盒(货号P0010,碧云天生物技术有限公司);RIPA裂解液(货号P0013B,碧云天生物技术有限公司);4×蛋白上样缓冲液(货号RM00101,武汉爱博泰克生物科技有限公司);SDS-PAGE凝胶配剂盒(货号G2003-50T,赛维尔生物科技有限公司);TRIzol试剂(货号QN2070,北京百普赛斯生物科技股份有限公司);肺炎链球菌液(货号B80921,宁波明舟生物科技有限公司);辛芷通窍颗粒(货号Z20073039,四川同人泰药业股份有限公司);ELISA试剂盒(货号EKHU3748,迪信泰检测科技有限公司)。一抗TNF-α(货号3707,美国CST公司)、IL-6(货号12153,美国CST公司)、IL-10(货号12163,美国CST公司)、IL-16(货号87477,美国CST公司)、IFN-γ(货号98139,美国CST公司)、HMGB1(货号3935,美国CST公司)、NLRP3(货号15101,美国CST公司)、ASC(货号67824,美国CST公司)、Cleaved caspase-1(货号89332,美国CST公司)、GAPDH(货号92310,美国CST公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠模型建立及给药:适应性喂养1周后进行实验。小鼠分笼饲养,每笼至多5只小鼠。饲养环境恒温22～25 ℃,自由饮水饮食,昼夜12 h交替,定期更换垫料。采用随机数字表法将50只小鼠分为假手术组、模型组、辛芷通窍低剂量组、辛芷通窍中剂量组、辛芷通窍高剂量组。采用开放上颌窦后接种3型荚膜型肺炎链球菌方法建立CRS小鼠模型。小鼠麻醉满意后,于小鼠鼻背正中处做一横行约3 mm的切口,钝性分离皮下组织,暴露上颌窦腔,于上颌窦左右两侧开口处磨一个直径约为1 mm的小孔。将含1 μl肺炎链球菌菌液的膨胀海绵植入窦腔内,逐层缝合皮肤。假手术组小鼠手术方式同模型组,但不植入含肺炎链球菌菌液的膨胀海绵。造模后第8周,记录小鼠一般情况及症状评分,总分≥5分认为造模成功。辛芷通窍低剂量组予以1.4 g/kg辛芷通窍颗粒、中剂量组予以2.8 g/kg辛芷通窍颗粒、高剂量组予以5.6 g/kg辛芷通窍颗粒,均灌胃治疗,相当于临床用量的0.8、1.6、3.2倍,假手术组及模型组小鼠灌胃等量0.9%氯化钠溶液。每天给药1次,连续给药2周。

1.2.2 HE染色:小鼠鼻窦黏膜组织经4%多聚甲醛固定后,梯度浓度的乙醇脱水,石蜡包埋。将组织块切成5 μm厚的切片,依次进行苏木精-伊红染色、乙醇脱水,再经二甲苯透明,滴加树胶、封片,在光镜下观察鼻窦黏膜组织病理改变。

1.2.3 ELISA法检测外周血炎症因子水平:末次给药24 h后,采集小鼠腹主动脉无菌血。静置1 h,室温、3000 r/min条件下离心10 min,收集上层血清,-80 ℃保存。根据制造商说明采用ELISA法测定小鼠外周血TNF-α、IL-6、IL-10、IL-16、IFN-γ表达水平。

1.2.4 RT-qPCR检测:根据制造商方案,使用Trizol试剂分离,提取鼻窦黏膜组织中总RNA。使用PrimerScript RT试剂盒(#RR037A,Takara)进行反转录。采用SYBR Premix Ex TaqTMTM Ⅱ检测相应目的基因表达。扩增反应条件为:95 ℃预变性10 min,循环40次(95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s),以GAPDH为内参基因,采用2-ΔΔCt方法计算mRNA的相对表达量,基因引物序列,见表1。

表1 引物序列

1.2.5 Western blot检测:将小鼠鼻窦黏膜组织置于冰上加入裂解液进行裂解,提取总蛋白并定量。以40 μg蛋白/孔的标准进行电泳,电泳后转移到聚偏二氟乙烯膜上,用牛血清白蛋白溶液封闭,与抗TNF-α、IL-6、IL-10、IL-16、IFN-γ、HMGB1、NLRP3、ASC、Cleaved caspase-1、GAPDH的一抗共同孵育,在4 ℃条件下孵育过夜。以GAPDH作为内参。用TBST洗膜3次,与二抗孵育1 h后使用增强型化学发光底物系统检测蛋白印迹。

1.3 统计学方法 所有实验独立重复至少3次,采用SPSS 20.0统计学方法进行分析。计量资料以均数±标准差表示,多组间比较用单因素方差分析(ANOVA),两两比较采用LSD-t检验;P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般情况比较 造模前,各组小鼠精神状态良好,皮毛健康有光泽,饮食饮水规律。造模后,各组小鼠饮食饮水明显较少,且出现鼻水流出、频繁挠鼻、打喷嚏、烦躁不安等症状,鼻腔内有少量分泌物出现,伴有不同程度的结膜水肿、眼角溢泪等表现。经过6周的药物干预后,假手术组症状评分为(0.09±0.02)分、模型组症状评分为(8.49±0.61)分、辛芷通窍低剂量组症状评分为(3.19±0.45)分、辛芷通窍中剂量组症状评分为(2.56±0.39)分、辛芷通窍高剂量组症状评分为(2.09±0.22)分,组间比较差异有统计学意义(F=18.32,P<0.05)。辛芷通窍低剂量组、辛芷通窍中剂量组、辛芷通窍高剂量组小鼠鼻窦炎症状评分均低于给药前,差异有统计学意义(均P<0.05),且辛芷通窍高剂量组小鼠鼻窦炎症状评分最低,辛芷通窍方呈明显的剂量依赖性。

2.2 各组小鼠鼻窦黏膜病理情况比较 见图1。假手术组小鼠鼻窦黏膜上皮细胞排列整齐,黏膜及黏膜下层有未见炎症细胞浸润。模型组小鼠鼻窦黏膜上皮纤毛脱落、炎症细胞渗入、腺体损伤、血管扩张和水肿。辛芷通窍低剂量组、辛芷通窍中剂量组、辛芷通窍高剂量组小鼠鼻窦黏膜中上皮纤毛及腺体损伤现象,但与模型组相比,炎细胞浸润程度、血管扩张和水肿程度相对较轻,鼻窦黏膜上皮细胞排列相对整齐,且辛芷通窍颗粒干预浓度越高,病变改善程度越明显。

A:假手术组;B:模型组;C:辛芷通窍低剂量组;D:辛芷通窍中剂量组;E:辛芷通窍高剂量组

2.3 各组小鼠外周血炎症因子水平比较 见表2。与假手术组相比,模型组小鼠外周血中TNF-α、IL-6、IL-10、IL-16、IFN-γ水平较高,差异有统计学意义(P<0.05)。辛芷通窍低剂量组、辛芷通窍中剂量组、辛芷通窍高剂量组小鼠外周血炎症因子水平低于给药前,差异有统计学意义(P<0.05),且辛芷通窍高剂量组小鼠外周血炎症因子水平最低,辛芷通窍中剂量组外周血炎症因子水平次之,辛芷通窍低剂量组小鼠外周血炎症因子水平最高,辛芷通窍方表现出明显的剂量依赖性。

表2 各组小鼠外周血炎症因子比较(pg/ml)

2.4 各组小鼠鼻窦组织中炎症因子水平比较 见表3(图2)。从本次观察可见,RT-qPCR及Western blot检测结果显示,与假手术组相比,模型组小鼠鼻窦黏膜组织中TNF-α、IL-6、IL-10、IL-16、IFN-γ的mRNA及蛋白相对表达较高,差异有统计学意义(均P<0.05)。辛芷通窍低剂量组、辛芷通窍中剂量组、辛芷通窍高剂量组小鼠鼻窦黏膜组织炎症因子低于模型组小鼠水平,差异有统计学意义(P<0.05),且辛芷通窍颗粒呈剂量依赖性地抑制鼻窦黏膜组织中炎症因子表达。

A:假手术组;B:模型组;C:辛芷通窍低剂量组;D:辛芷通窍中剂量组;E:辛芷通窍高剂量组

表3 各组小鼠鼻窦黏膜组织中炎症因子mRNA表达比较

2.5 各组小鼠鼻窦黏膜HMGB1/NLRP3信号通路相关因子表达 见图3。Western blot检测结果显示,与假手术组相比,模型组小鼠黏膜组织中HMGB1、NLRP3、ASC和Cleaved caspase-1蛋白表达升高。与模型组相比,辛芷通窍低剂量组、辛芷通窍中剂量组、辛芷通窍高剂量组小鼠鼻窦黏膜组织中HMGB1、NLRP3、ASC和Cleaved caspase-1 蛋白表达降低,且呈辛芷通窍颗粒剂量依赖性。

A:假手术组;B:模型组;C:辛芷通窍低剂量组;D:辛芷通窍中剂量组;E:辛芷通窍高剂量组

3 讨 论

中医认为,鼻窦是人体卫气之源,与肺经关系紧密[6-8]。生理情况下,鼻窦内的气血运行顺畅,能够保持呼吸通畅以及鼻腔黏膜的正常功能,当外邪侵入或体内邪气聚集-导致鼻窦黏膜受损,气血瘀滞不畅,即会引发CRS[9-12]。辛芷通窍颗粒是一种中药制剂,具有祛邪解表、宣发散寒作用,能够祛除风寒邪气,促进鼻窦血液循环,改善鼻窦黏膜的炎症[13-15]。

本研究发现,模型组小鼠的正常鼻窦黏膜组织结构被显著破坏,外周血炎症因子水平最高;辛芷通窍颗粒各剂量组小鼠鼻窦黏膜中炎性细胞浸润程度、血管扩张、水肿程度相对较轻,鼻窦黏膜上皮细胞排列相对整齐,外周血炎症因子水平较低,且辛芷通窍颗粒干预浓度越高,病变改善程度越明显,表明辛芷通窍颗粒中的活性成分具有鼻窦黏膜损伤的保护作用。可能的机制包括辛芷通窍颗粒中的活性成分具有抗炎作用,能够减轻炎症细胞渗出。炎症细胞的积聚会产生炎症介质,如TNF-α、IL-6等,这些介质会引起局部血管扩张和水肿。辛芷通窍颗粒通过抑制炎症介质产生,减轻血管扩张和水肿程度;辛芷通窍颗粒也可能对鼻窦黏膜上皮细胞具有保护作用[16]。鼻窦黏膜上皮细胞的纤毛脱落是慢性鼻窦炎的典型特征,而辛芷通窍颗粒通过促进纤毛再生或抑制纤毛脱落过程,减轻鼻窦黏膜上皮纤毛损伤[17-18]。此外,辛芷通窍颗粒还能保护鼻窦黏膜腺体,减轻其受损程度。

HMGB1/NLRP3信号通路在CRS的病情进展中具有重要作用[12]。HMGB1是一种核蛋白,在细胞损伤和炎症反应中释放,并参与调节炎症介质的产生[19]。NLRP3是一种炎症小体成分,参与炎症反应和细胞凋亡调控[20-23]。在包括CRS在内的慢性炎症发展过程中,HMGB1和NLRP3的异常活化与炎症反应的持续存在密切相关,二者的激活可以导致炎症介质的产生和炎症反应的持续存在[24]。促进炎症细胞因子的释放和炎症细胞浸润,进一步加剧局部组织的炎症反应。同时,HMGB1和NLRP3的异常活化可诱导细胞凋亡和细胞损伤,诱导鼻窦黏膜的结构破坏和功能障碍,加重CRS严重程度[25-26]。本研究发现,辛芷通窍颗粒可有效抑制小鼠鼻窦黏膜中HMGB1/NLRP3信号通路激活,表明HMGB1/NLRP3信号通路是辛芷通窍颗粒治疗CRS的重要靶点,通过调节炎症反应失衡,抑制炎症因子的持续改善。

综上所述,本研究发现辛芷通窍颗粒呈剂量依赖性地抑制HMGB1/NLRP3信号通路激活,抑制CRS小鼠鼻窦黏膜炎症水平。然而,CRS的发生发展涉及众多因素,机制复杂,因此辛芷通窍颗粒改善CRS症状的具体机制仍有待进一步研究。