沙眼衣原体外膜复合物蛋白B的研究进展

孙悠娴, 齐蔓莉

1.天津医科大学总医院,天津 300052; 2.天津市人民医院,天津 300000

沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis,CT)是性传播感染的主要病原体之一。据世界卫生组织发布的报告[1],CT每年约有1.285亿新增病例,男性约6 990万,女性约5 860万。CT感染目前已是最常见的性传播疾病之一。在女性群体中约有70%～80%呈无症状感染,若不加以治疗控制,会引起女性上生殖道的瘢痕,并最终导致盆腔炎、异位妊娠、不孕症等严重的后遗症[2-3]。此外,有研究表明CT与HPV感染相关的宫颈癌有所关联[4];CT感染还会使人类免疫缺陷病毒感染和传播的风险增加3～4倍[5]。因此,CT感染的防治需引起足够重视。CT有严格胞内寄生的特性且拥有独特的双相发育周期[6-7],一种是形态较小的(直径约200 nm)、具有感染性和非复制性的原体(elementary bodies, EBs),另一种是形态较大的(直径约800 nm)、非感染性和具有繁殖复制能力的网状体(reticulate bodies, RBs)。在CT的发育周期中,EBs通过内吞作用附着并进入宿主粘膜细胞后,被内化在细胞内包涵体中。内化后约2 h,EBs经二硫化物还原扩大,分化成RBs。RBs在感染后约6 h经过几轮复制重新分化为EBs。在发育周期末,包涵体占据了宿主细胞大部分细胞质。感染48～72 h后,大量感染性EBs从宿主细胞中释放出来,感染邻近的上皮细胞并使得CT感染的过程持续存在。CT的感染依赖于其对宿主细胞的黏附和入侵机制,该机制与CT的免疫优势蛋白息息相关[8],这些蛋白包括主要外膜蛋白(MOMP)、热休克蛋白70(HSP70)、质粒蛋白pgp3以及外膜复合物蛋白B(OmcB)等。OmcB在衣原体中是含量第二丰富的外膜蛋白[9-10],在衣原体感染过程中表现出强大的免疫原性[11],在帮助CT感染的诊断以及疫苗研发方面具有很好的应用前景。因此,本文对OmcB的结构、定位及作用机理等相关研究进行综述。

1 外膜复合物蛋白B的结构

外膜复合物蛋白B(outer membrane complex protein,OmcB),也被称为CT443,其基因长度为1 659 bp,分子质量约为60 kD。OmcB是一类富含24个半胱氨酸残基的外膜多肽,在衣原体中是第二丰富的外膜蛋白,含量仅次于MOMP[9-10]。OmcB可以被分为一个具有高度保守性的C端部分,以及一个具有物种特异性的N端部分[12]。衣原体的所有OmcB蛋白在其N端结构域中都至少有一个XBBXBX序列(图1),该序列已被证实与介导衣原体黏附相关。OmcB C端CD8表位的鉴定表明C端可进入宿主细胞的细胞质[13]。OmcB蛋白在不同种衣原体之间具有高度保守性[14],Wang等[11]通过分析血清型D CT OmcB开放阅读框序列,并与其他衣原体序列进行BLAST分析,发现血清型D与H、G和K之间同源性为100%,与血清型B和C有99%同源性,与L1-L3之间亦有98%的同源性,表明OmcB在衣原体感染过程中起重要作用。这意味着OmcB或许在衣原体疫苗的研究上具有一定潜力。

SS:信号序列;BD:OmcB结合结构域;N-terminus:OmcB N末端,为OmcB结合结构域,具有物种特异性;C-terminus:OmcB C末端,具有高度保守性;标红区域为OmcB结合结构域(OmcB-BD),内含至少一个XBBXBX基本序列(B代表一种碱性氨基酸),可与肝素结合。

2 外膜复合物蛋白B的定位

关于OmcB的定位曾存在一定争议。Everett等[15]认为OmcB完全位于周质而非暴露于表面或定位于外膜上。相较之下,Ting等[16]发现鹦鹉热衣原体的 OmcB也对EBs的胰蛋白酶消化敏感,并提出OmcB可能是暴露在细胞表面的。Mygind等[17]试图通过免疫电子显微镜观察OmcB特异性抗体解决沙眼OmcB表面定位问题,发现OmcB位于外膜内表面,只有在用还原试剂和蛋白裂解酶处理后才能到达细胞表面。然而在此前的研究中,由于表面暴露的OmcB区域有限,或是由于针对整个OmcB蛋白产生的抗体无法识别OmcB的构象表位,导致这些抗体无法与完整的EBs结合。Fadel等[8]从血清型LGV1中将OmcB分离并测序,克隆表达于大肠杆菌,最终蛋白酶裂解的结果表明重组OmcB蛋白的部分位于大肠杆菌的外膜内表面上,其余部分位于周质中;体外感染抑制试验表明使用抗OmcB有效抑制LGV1的感染,提示在沙眼衣原体表面确有OmcB蛋白暴露,并且在免疫功能方面可与抗体发生结合。

3 外膜复合物蛋白B的作用机理

得益于OmcB在CT感染中的丰富性和免疫原性,在诊断和疫苗研发方面,OmcB一直被视作一个重要研究靶点。鉴于CT感染症状的隐匿性及其并发症的危害性,CT感染者的早期筛查和后续充分治疗对CT感染的防控工作具有重要意义。然而目前国内各种检测方法存在一定缺陷,如侵入性检查在取材时给患者造成痛苦、耗时费力、检测结果敏感性不高和特异性不高等问题[18]。血清学检查中血清中pgp3、MOMP、HSP60抗体在临床应用中同样存在局限性[3,9,19]。已有研究验证,在感染衣原体患者的血清中可检测出高滴度的抗MOMP、衣原体蛋白酶样活性因子(Chlamydial protease-like activity factor, CPAF)、易位肌动蛋白募集磷酸化蛋白 (translocated actin recrui-ting phosphoprotein, Tarp)等特异性抗体,这些免疫优势蛋白已被运用于疫苗的研发之中[20-22]。同样提示OmcB作为一类免疫优势蛋白,在衣原体感染的早期检测、诊断和疫苗研发方面或许存在着可期的研究空间与前景。

3.1 OmcB是一种免疫优势蛋白

在CT感染过程中,OmcB已被证实是一种免疫优势抗原。不管是在动物还是在人类CT感染中都可介导产生强烈的免疫反应。

CD8+T细胞通过裂解受感染细胞以及分泌细胞因子的机制在解决多种胞内细菌感染方面发挥效应。有研究发现人类CD8+T细胞可以识别OmcB,第一次运用CT感染的树突状细胞获得克隆的人类CD8+T细胞,验证出OmcB为CT的一种抗原,通过MHC Ⅰ类加工途径并以此刺激人类CD8+T细胞,这是人类对此病原体产生免疫反应的第一步,激活CD8+T细胞免疫反应也是抵抗CT感染所必需的步骤[13]。Telyatnikova等[23]通过从CT诱导的反应性关节炎患者的滑液淋巴细胞中克隆并表达了CT特异性CD4+T细胞,发现人类CD4+T细胞可以识别OmcB。这些结果说明OmcB在T细胞介导的CT感染的免疫过程中发挥了作用。

克隆表达OmcB全长基因存在一定困难。Wang等[11]以OmcB的C端为研究对象,采用PCR技术从基因组中扩增C端序列,构建OmcBc重组质粒,成功诱导表达重组OmcBc融合蛋白;同时该研究收集120例CT感染患者血清,并对家兔和小鼠进行免疫接种或感染,获得7份兔免疫血清、9份腹腔免疫小鼠血清、5份滴鼻感染小鼠血清,对倍稀释后用IFA检测各份免疫血清效价,结果显示,在1 ∶5 000稀释下的人免疫血清中,CT的包涵体依然可以清晰着色,而兔和小鼠的血清效价均大于1 ∶10 000;ELISA检测结果表明在120例患者免疫血清中,重组OmcBc融合蛋白反应阳性率为87.5%;家兔和小鼠免疫血清与重组OmcBc融合蛋白均可发生强烈的抗原抗体反应,反应频率为100%。由此可见重组OmcBc蛋白具有很强的抗原性。此项研究证明无论CT的增殖过程是否发生在宿主细胞内,免疫细胞对OmcB的呈递过程依然可以照常进行并进一步诱导机体产生特异性免疫应答。

OmcB属于晚期基因[24]。Qi等[25]为监测全长OmcB蛋白的表达,用1%SDS透化CT感染的细胞,在感染后2 h可检测到EBs中预先存在的OmcB,但在感染后12 h和18 h消失,在24 h可检测出新合成的OmcB,感染后36 h检测到OmcB与生物体广泛重叠;用2%皂苷透化后可明显观察到在感染后24 h,有OmcBc分泌到宿主细胞胞质中,这表明分泌的OmcBc可能是由新合成的OmcB主动加工而成的。

Qi等[25]针对OmcB C端和N端片段分别构建抗OmcBc抗体和抗OmcBn抗体,在宿主细胞被CT感染后,在其细胞质中检测到很强的抗OmcBc抗体信号,而抗OmcBn抗体只在衣原体包涵体内部检测出信号;经各项试验证明,OmcBc片段被释放到宿主细胞胞质中,而OmcBn片段和剩余的全长OmcB被保留在衣原体包涵体中;同时该研究为验证CT感染期间OmcBc具有高度免疫原性,使用了20例感染沙眼衣原体女性的抗血清,通过ELISA和免疫印迹法绘制OmcB的免疫显性区域。在ELISA中,这20例中抗血清均阳性识别全长OmcB,汇集20种人抗血清时也得到相似的结果;使用蛋白质印迹分析也证实了人抗体对 OmcBc片段的显性识别。实验中,即使人抗血清的稀释度很低,合并的阳性抗血清也能识别 OmcB 的所有C末端片段而非N末端片段,这证实了OmcBc的免疫优势。OmcBc片段表现出与全长OmcB相似的抗原性,这表明OmcBc在OmcB的免疫原性表达方面占绝大部分作用。而OmcBc在CT感染期间被释放到宿主细胞胞质中,同时分泌的OmcBc可以方便提取到溶液中以进行抗体的识别,也表明其可以用于研发一种基于免疫组化的OmcBc快速检测方法。

Hou等[26]研究发现CPAF在处理OmcB使其裂解成OmcBc的过程中发挥重要作用。CPAF是一种丝氨酸蛋白酶,由包涵体内CT分泌后可通过Sec依赖性途径[25]进入宿主细胞周质空间,这表明CPAF可能是切割 OmcB 的候选蛋白酶。OmcB在CT感染晚期的加工处理发生在CPAF合成并活化之后,监测CPAF的表达可发现在检测到加工后的OmcBc之前检测到了活性CPAF,表明CPAF处理OmcB的可能性。并且CPAF在经CPAF特异性抗体消耗之后以及被一种CPAF特异性抗体抑制肽处理之后,OmcB的处理也得到抑制。在该研究中Hou等还监测了宿主细胞的完整性以及感染时间过程,未发现明显的细胞膜通透性变化,这表明OmcB加工确实发生在活细胞中,而非细胞死亡。Chen等[27]发现CPAF可能通过外膜囊泡(OMV)出芽机制分泌出CT并进入宿主细胞。而OmcBc也被证明可以释放到宿主细胞的细胞质中。因此,OmcBc有可能通过与CPAF共同包装到OMV中并进入宿主细胞的细胞质发挥作用。

3.2 OmcB介导CT对宿主细胞的黏附

OmcB可以作为CT侵入宿主细胞的黏附素。在OmcB蛋白的N-端结构域中至少存在着一个XBBXBX序列(B代表一种碱性氨基酸),此序列以及N-端碎片所对应的的合成肽,被证实可与肝素相结合来阻断某些沙眼衣原体血清型的感染性[28-29]。在宿主细胞膜上存在着硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycan, HSPG),属于粘多糖(glycosaminoglycan,GAG)家族中的一员,现已被证实可与CT细胞外基质蛋白结合介导细胞黏附和迁移,是衣原体感染的必要条件[30]。Fadel等[8]研究发现血清型LGV1的重组OmcB蛋白与GAGs缺陷型宿主细胞的结合大大减少,表明OmcB可以与宿主细胞膜上的GAGs受体特异性结合从而增强衣原体对宿主细胞的黏附。

Fadel等[31]进一步研究发现,不同于血清型LGV1,在血清型E中,OmcB蛋白虽然也存在黏附性,但其与宿主细胞的结合并不依赖于GAGs。感染性抑制实验显示在保持同样存在肝素这一相同条件下,只有表达了血清型LGV1的OmcB的大肠杆菌的黏附性被显著抑制(68%),血清型LGV1的重组OmcB与GAGs缺陷型细胞的结合显著减少,而对于同一缺陷细胞,来自血清型E的重组OmcB的结合数量与野生型细胞相当。

衣原体OmcB与宿主细胞的黏附是否依赖于GAGs取决于OmcB C端的3个可变氨基酸(第66、68、71位氨基酸)到保守的XBBXBX肝素结合结构域[12],其中,第66位氨基酸是决定其依赖性的最主要因素,当血清型E的OmcB蛋白的第66位亮氨酸被血清型LGV的OmcB中相应位置的脯氨酸所取代后,由肝素非依赖转变成了肝素依赖。相对应地,当血清型LGV的OmcB蛋白的第66位脯氨酸被亮氨酸取代后,其肝素依赖性也同样发生了改变。

3.3 OmcB维持EBs细胞壁刚性和渗透稳定性

EBs的细胞壁成分又被称为衣原体外膜复合物(Chlamydia outer membrane complex, COMC)[32],它不溶于肌氨酸,除了含有主要外膜蛋白(MOMP)、富含半胱氨酸蛋白(Cysteine rich proteins, Crp)、多形态膜蛋白(polymorphic membrane proteins, Pmps)外,还具有一种刚性外膜,这种膜结构由二硫化物交联的富含半胱氨酸的蛋白质网构成,即OmcB,有助于提高EBs对于外界环境压力的抵抗力。Newhall等[33]表明OmcB可能参与RBs到EBs的转化过程并且在维持EBs的细胞壁刚性和渗透稳定性方面发挥作用,其研究数据表明,在衣原体感染Hela细胞30 h后,细胞内RBs转化为EBs时,才检测到了OmcB蛋白的合成,这表明衣原体外膜蛋白的合成时间和程度受到调控,且这种调控在时间上与RBs到EBs的分化过程相吻合。此外,该项研究还显示在外膜蛋白的生长周期内,OmcB蛋白的二硫键在大部分时间中广泛交联。

4 结语与展望

OmcB蛋白是衣原体中含量仅次于MOMP的外膜蛋白,其独特结构可以帮助维持衣原体EBs的细胞壁刚性及渗透稳定性。在介导CT对宿主细胞的黏附与入侵过程中,OmcB蛋白发挥了重要作用,其与宿主细胞膜上的GAGs受体特异性结合从而增强衣原体对宿主细胞的黏附。同时对OmcB的研究也帮助我们对于衣原体致病机制的理解方面有所加深。多项体内外实验结果已证实OmcB是一种免疫优势抗原,不管是在动物还是在人类CT感染中都可介导产生强烈的免疫反应。但OmcB作为一类免疫优势蛋白,其与宿主细胞的相互作用机制尚未完全明了,其在衣原体感染的早期检测以及有效疫苗研制方面存在着可期的研究空间与前景,值得进一步研究。