黄曲霉毒素在肉鸡肝脏中的代谢规律研究

张蓉银，杜婷婷，魏佩玲，王晓涛，胡 波

（新疆畜牧科学院畜牧业质量标准研究所，新疆乌鲁木齐 830026）

霉菌毒素是由曲霉菌、镰刀菌、青霉菌和链格孢菌等真菌产生的天然有毒次级代谢产物（Steynp，1995），迄今为止，已在自然界中发现了超过500 多种霉菌毒素。其中黄曲霉毒素（Aflatoxin，AF）是由曲霉菌产生的毒性最强的毒素，具有肝毒性、致癌性、诱变性和致畸性（Johan等，2010），也是污染玉米、花生、小麦、坚果、油性饲料、饲草产品等饲料原料的主要污染毒素（史海涛等，2019 ；黎进，2016）。畜禽受黄曲霉毒素中毒后其肝脏酶活、组织形态异常严重影响了肝脏功能（Cast，1989）。因此，研究AFB1在靶组织中的代谢规律受到广泛关注。本文选用白羽肉鸡为研究对象，利用非靶向代谢组学方法探讨不同浓度的黄曲霉毒素对肉鸡肝脏组织的影响，为实际养殖过程中检测黄曲霉毒素提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试验设计 试验将80 只21 日龄、平均体重816 g 的白羽肉鸡随机分为4 组，分别为对照组（DZ）、低剂量组（D）、中剂量组（Z）、高剂量组（G）。每组4 个重复，每个重复5 只。采用层叠笼养，自由采食和饮水，常规免疫。对照组饲喂基础日粮，试验组以玉米油作为溶剂进行注射器灌服，低剂量组灌服浓度为2.4μg/mL；中剂量组灌服浓度10μg/mL 的AFB1；高剂量组灌服100μg/mL的AFB1，每天灌服1 次，每次1 mL，连续灌服7 d。

1.2 主要试剂与设备

1.2.1 试剂 甲醇、甲酸、水、乙腈试剂均购自Finsher 公司，均为分析纯或色谱级。

1.2.2 主要仪器 SB-5200DT 超声波清洗仪（宁波新芝生物科技有限公司）；TYXH-I 漩涡振荡器（上海汗诺仪器有限公司）；TGL-16MS 台式高速冷冻离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；LNG-T98 冷冻浓缩离心干燥机（太仓市华美生化仪器厂）；Sciex TripleTOF 6600 高分辨质谱仪（赛默飞世尔科技公司）；Agilent 1290 高效液相色谱仪（赛默飞世尔科技公司）；ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8μm）色谱柱（Waters）。

1.2.3 肉鸡屠宰和肝脏样品采集 饲喂前各试验组分别屠宰5 只肉鸡，其余肉鸡待药物灌服7 d后统一屠宰。宰前称重，记录宰前活重、每日饲喂量。屠宰时采用颈动脉放血法，去除头、羽、爪部位，完整采集鸡肝脏样本，液氮保存。

1.2.4 代谢物提取 取0.1 g 肝脏样品，加入80% 预冷的甲醇1 mL，使用组织匀浆机将肝脏充分研磨。研磨后的样品在4℃的条件下15000g离心15 min，收集上清液，经旋蒸干燥后，加入1mL 50% 的甲醇复溶，过0.22μm 滤膜过滤后进行LC-MS/MS 分析。

1.2.5 液相色谱- 质谱条件 色谱条件：色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3 （100 mm×2.1 mm，1.8μm）；柱温：45℃；流动相：A-水（含0.1%甲酸），B-乙腈（含0.1%甲酸）；流速：0.35 mL/min；进样体积：2μL。

表1 洗脱梯度

表2 质谱参数

1.2.6 代谢物鉴定和统计分析 使用MSDIAL 4.9 对原始数据做峰提取、峰对齐等数据处理，基于MS-DIAL metabolomics MSP 数据库进行鉴定，同时进行理论碎片识别。分析前先对数据进行归一化处理，采取总峰面积归一化即每个样本的每个代谢物除以该样本总的峰面积。

2 结果与分析

2.1 对肉鸡生长性能的影响 由表3 可知，与对照组相比，高浓度组对肉鸡平均日增重产生显著影响（P＜0.05），高、中、低组对肉鸡的平均日采食量无显著影响（P＞0.05），各饲喂组均未出现肉鸡死亡状况。

表3 AFB1 对肉鸡生长性能的影响

2.2 灌服AFB1对肝脏代谢的影响 采用非靶向代谢组学分析流程，使用C18 分离肝脏代谢物，于正、负离子两种质谱模式进行数据采集，共鉴定到4473 个代谢物，使用PCA 无监督多维方法分析不同剂量组与对照组定量结果。由图1 可知，与对照组相比，灌服AFB1的代谢物明显发生了变化，但不同剂量之间差异不显著。

图1 肝脏中不同剂量组间的PCA 得分图

图2 肝脏中不同剂量组间的代谢差异物火山图

2.3 肉鸡中AFB1的差异代谢物火山图分析 为了进一步分析AFB1影响肝脏代谢物的种类，采用T-test 的方法分别分析了低，中、高组相比对照组中差异代谢物的变化趋势，在变化倍数≥2 倍，P＜0.05 的条件下共鉴定到242 个化合物，其中132 个化合物上调，110 个化合物下调。以火山图展示代谢物表达差异的分布，其中横轴表达代谢物差异倍数，越偏离中心差异倍数越大，纵轴值越大差异越显著。如图2 所示，其中低剂量组有37个差异化合物显著下调，30 个差异化合物显著上调；高剂量组有36 个差异化合物显著下调，46个差异化合物显著上调；中剂量组中44 个差异化合物显著下调，52 个差异化合物显著上调。

2.4 肉鸡中AFB1差异代谢物的层次聚类分析为进一步展示受影响的化合物在肝脏中的变化情况，使用热图对不同剂量组进行聚类分析，如图3所示，其中横轴表示低（D）、中（Z）、高组（G）和对照组（DZ），纵轴表示相应差异代谢物，红色越深代表该代谢物相对调高，绿色越深代表该代谢物相对调低。由图3 可知，各剂量组中的差异代谢物种类与对照组相比变化明显，可能是由于AFB1剂量升高，导致对肝脏代谢功能造成相应程度的损伤。

图3 肝脏中不同剂量组间层次聚类分析热力图

2.5 肉鸡肝脏中的显著性差异代谢物 由表4可知，在242 个差异化合物中，与对照组相比，低、中、高剂量组上调的差异化合物132 个，下调的差异化合物110 个。经HMDB 数据库比对进一步筛选出变化最为显著的内源性代谢物10 个，其中上调的代谢物9 个，下调的代谢物1 个。

表4 各试验组肉鸡肝脏中显著性差异代谢物信息

3 讨论

动物采食AFB1后会引起采食量下降、料重比、日增重增加，更有甚者还会对肝脏、肾脏、胸腺等器官造成一定损伤，长期采食会导致动物的肝、肾、肌肉等产品中沉积AFB1，从而通过食物链危害人体健康。Siloto 等（2013）在饲料中加入1 mg/kg 的AFB1，结果发现，鸡肝脏颜色变黄，肝脏发生明显的脂肪蓄积，肝脏重量增大，血浆极低密度脂蛋白和甘油三酯浓度下降。石达友等（2010）研究表明，给雏鸭服用AFB1后，肝脏线粒体膜通透性的变化趋势与AFB1剂量成正相关性，即AFB1剂量越大，线粒体受损伤程度越严重，这可能是AFB1肝毒作用机理之一。Ishikawa 等（2017）研究表明，毒素浓度与肝脏损伤之间存在直接相关性。

在本试验中，肉鸡采食含有AFB1的日粮后发现，肝脏中均有一定程度的蓄积，其中高浓度产生的代谢产物变化，且随AFB1浓度的升高，代谢产物变化种类越多。肝脏中差异化合物分子大多为脂类和氨基酸类物质，磷脂是构成质膜的主要成分，与其他两组相比，高剂量处理组中的磷脂类物质显著升高，这与LU 等（2011）的研究结果一致，说明高剂量的AFB1可导致肝脏损伤，内源性脂类物质迅速增加，发生肝脏脂肪堆积，膜崩解和急性细胞肿胀。Harvey 等（1990）研究发现，通过给猪饲喂AFB1污染的日粮，其肝脏、肾脏和肝脏脂肪的相对重量明显升高。这与本试验结果一致。

4 结论

综上所述，通过AFB1对肉鸡肝脏组织的代谢组学分析发现，白羽肉鸡采食含有AFB1的饲料后会引起肝脏组织内不等量残留，且随着饲料中AFB1浓度的增加，加重了肝脏的损伤情况。