基于网络药理学及分子对接探究地参三萜酸保肝作用机制

杨勤，李金金，周浓

（1.重庆三峡医药高等专科学校，重庆 404120；2.重庆三峡学院生物与食品工程学院，三峡库区道地药材绿色种植与深加工重庆市工程实验室，重庆 404120）

肝脏为人体五脏之一，可维持人体新陈代谢的稳定，具有造血、代谢营养物质、排解体内毒素、分泌和排泄胆汁等生理功能。生物性病原菌、药物及肝毒性物质、免疫性低下、酒精刺激及营养物质缺乏等因素均会引起肝损伤。长期反复的肝损伤会破坏肝脏组织的正常结构，肝脏的各种功能减弱从而导致肝再生能力降低。因而进一步研究有效的生物活性成分并探明其对肝功能的促进再生、修复作用机制具有重要的意义。

地参（Lycopus lucidus Turcz.）为唇形科药材泽兰的地下部分，形似地蚕，气香、味甘，是良好的药食同源植物资源[1-2]。地参药用价值在众多典籍皆有记载，具有化瘀止血、益气利水、气虚乏力之功效。近年来的研究表明，地参具有保肝[3]、抗氧化[4]、降血糖血脂[5-6]等功能，其提取物中含有的三萜类物质有降低肝硬化、保护肝脏功能的作用。参考前期实验[4]，地参中三萜酸生物活性已有研究，含量依次为白桦脂酸、熊果酸、齐墩果酸，三种化合物都为五环三萜化合物，其单一化合物均有改善肝脏疾病的相关文献报道，徐立新[7]等研究表明白桦脂酸可通过缓解脂质过氧化和氧化应激改善（四氯化碳）CCl4诱导肝损伤；张明发[8]等研究表明熊果酸和齐墩果酸的抗氧化作用能对抗各种原因引起的氧化应激所致的肝组织炎性损伤、脂肪变和纤维化。为探讨地参中萜类对肝脏保护作用的潜在机制，本研究构建网络药理学及分子对接来对地参萜类成分保肝机制进行阐释。

一、资料与方法

（一）地参活性成分检索

利用TCMSP数据库检索地参活性化学成分，研究针对地参中主要萜类成分，结合地参有药理作用成分的生物活性成分参考，预测地参萜类的保肝作用机制。

（二）地参三萜酸药理成分对应靶点的获取

白桦脂酸、齐墩果酸、熊果酸三种萜类结构通过使用Pubchem数据库获得，将获取的化学式结构导入PharmMapper数据库和Swiss Target Prediction数据库，进而可得作用靶点，输入至uniprot数据库，再将靶点名称矫正统一，经去重后获得所需靶点。

（三）保肝相关靶点的筛选

在数据库检索“liver protection”相关的靶点基因，通过Venny 2.1在线软件作图工具平台分析地参萜类成分和疾病靶点信息的筛选结果，图示可直观得到共同靶点。

（四）药物-疾病-共同靶点的筛选

将有效成分靶点和关键通路导入软件进行可视化处理，并对各药物化学成分进行形状、颜色识别标注，化学成分与靶点的关系使用Network Analyzer功能对三萜酸的主要活性成分进行分析。

（五）构建靶蛋白相互作用网络

在STRING数据库获得交集作用靶点，明确萜类保肝靶点之间的相互作用，构建PPI网络图。基于拓扑分析的核心靶点筛选如下，导入Cystoscap 3.9.1中，拓扑分析由Network analyzer插件分析，根据degree值选取核心的靶点。

（六）GO 富集及KEGG 富集

将地参三萜酸保肝潜在作用靶点信息导入David（生物学信息注释数据库）数据库分别勾选生物过程、分子功能、细胞组成、KEGG 信号通路，利用R语言的Clusterprofile程序包进行GO基因富集分析和KEGG通路富集分析,设定PValue ≤0.05得到相应的生物学过程及KEGG通路相关数据，然后将所得KEGG数据导入Cytoscape 3.7.2进行可视化图形绘制。

（七）分子对接

配体处理：从Pubchem数据库下载化合物的SDF格式，导入Chemdraw 3D中，利用MM2模块进行能量最小化，获得能量最低的优势构象并保存为mol2文件，并使用AutodockTools1.5.6对配体进行加氢、加电荷、检测配体的root、进行可旋转键的搜寻与定义，并保存为pdbqt文件。

受体处理：从RCSB PDB数据库下载得到蛋白的三维结构，利用PYMOL对蛋白进行去水分子、去小分子，再通过AutodockTools1.5.6添加氢原子、计算Gasteiger电荷，将其定义为受体并保存成pdbqt文件。

对接过程：使用Autodock vina 1.1.2将配体与受体进行对接，选取对接结合能最低的构象用于对接结合模式分析，并用PYMOL分析结合模式并进行可视化。

二、结果分析

（一）三萜酸成分及靶点筛选

通过TCMSP数据库检索泽兰筛选出三萜酸活性成分，选取白桦脂酸、齐墩果酸、熊果酸三种三萜酸类研究其保肝作用，并使用Pubchem数据库获得三种三萜酸的结构，导入PharmMapper数据库（取Norm Fit预测得分大于0.6的靶点）和Swiss Target Prediction数据库获取作用靶点，经uniprot数据库对靶点名称矫正统一并去重后共获得185个靶点。

（二）疾病作用靶点筛选

以“liver protection”为关键词分别在数据库（取relevance score大于10的靶点）进行检索，去重后共获得疾病靶点833个。

（三）药物-疾病-共同靶点的筛选

将185个药物靶点、833个疾病靶点输入至线上软件作图工具平台中，由两者取交集后获得药物-疾病交集靶点58个（见图1）。

图1 三萜酸与肝保护靶点韦恩图

（四）成分-靶点-疾病网络构建及分析

三萜酸的主要活性成分进行分析后，采用Cytoscape软件，将三萜酸中3个潜在活性成分与58个药物-疾病共同靶点分析，“成分-靶点-疾病”网络图绘制如图所示 （图2）。3种活性成分由黄色代表，蓝色代表58个共同靶点，红色代表疾病。通过图2可以看出地参中三萜酸成分对应靶标来发挥对肝脏的保护作用。

图2 活性成分-靶点-疾病网络图

（五）PPI 网络构建及核心靶点分析

构建蛋白相关作用关系网络图 ：将上述药物-疾病共同靶点输入到STRING数据库中进行检索，设置蛋白种类为“Homo sapiens”，最低相互作用阈值为0.7，去除孤立节点，构建蛋白相互作用的PPI网络（图3）。PPI网络中，一个基因靶点由每个节点表示，两个靶点之间的相互作用关系用线线连接。将PPI网络导入Cystoscap 3.9.1中，通过Network Analyzer工具进行拓扑分析，选取degree值大于平均分的基因作为核心靶点，在条形图（图4）中可得度值最高的3个靶点是HSP90AA1（度值20）、MAPK3（度值20）、MAPK1（度值19）。

图3 PPI网络

图4 核心靶点排序

（六）GO 富集及KEGG 富集

使用David数据库对共同靶点进行GO与KEGG富集分析，并使用R语言对富集结果进行可视化，将58个共同靶点经David数据库GO富集分析得到生物学过程、细胞组分及分子功能3部分。GO结果显示，交集基因共富集至281条生物过程通路中；交集基因共富集至33条细胞组分表达过程中；交集基因共富集至76条分子功能相关的过程中，选取每部分Pvalue排名前10的通路绘制条形图气泡图（图5）。将58个共同靶点经David数据库KEGG富集分析后共得到126条KEGG通路，选取Pvalue排名前20的通路绘制KEGG富集的条形图气泡图（图6），-log10(Pvalue)代表富集的显著性，颜色越红则显著性越高。注：一般选择Pvalue ＜0.05的通路进行研究。

图5 GO富集分析

图6 KEGG富集分析

（七）分子对接

分子对接常用于药物活性分子与靶蛋白的对接分析。将Degree值前5个重要靶点蛋白HSP90AA1、MAPK1、MAPK3、SRC、EGFR，以及3个活性成分Betulinic acid（白桦脂酸）、Oleanolic acid（齐墩果酸）、Ursolic Acid（熊果酸）进行分子对接验证。由表1可知，地参中三萜酸靶点的结合能均＜-7.3 kcal/mol，即结合性较好。由图7可知，这些化合物主要与蛋白受体结合位点发生氢键作用。

表1 三萜酸与关键靶点对接能

图7 分子对接结合能热图

利用Autodock vina对接，化合物和蛋白的最低结合能结合自由能（Affinity）越小表示化合物能够强有力自发地结合到蛋白的活性口袋中，小分子能够良好地进入到蛋白的活性口袋具有良好的形状匹配，利用PYMOL进行相互作用分析，从三维分析发现，化合物与氨基酸形成的氢键相互作用，这些相互作用使得化合物能够良好地结合到蛋白口袋中，进一步发挥作用。由图8（A）所示，化合物和蛋白的最低结合能为-9.2kcal/mol，结合能小于-7，从三维分析发现，化合物与氨基酸ALA165形成氢键相互作用,其氢键的距离为2.1埃。由图8（B）所示，化合物和蛋白的最低结合能为-10.4kcal/mol，结合能小于-7，从三维分析发现，化合物与氨基酸MET108、THR110形成氢键相互作用,其氢键的距离分别为3.4、2.1、2.6埃。由图8（C）所示，化合物和蛋白的最低结合能为-9.8kcal/mol，结合能小于-7，化合物与氨基酸ARG41形成氢键相互作用,其氢键的距离为2.5埃，由图8（D）所示，化合物和蛋白的最低结合能为-9.9kcal/mol，结合能小于-7，化合物与氨基酸ARG156形成氢键相互作用,其氢键的距离为2.5埃。由图7（E）所示，化合物和蛋白的最低结合能为-10.1kcal/mol，结合能小于-7，化合物与氨基酸LYS745形成氢键相互作用,其氢键的距离分别为2.4、2.2埃。

图8 地参3 种化合物与关键靶点相互作用图

三、讨论

本研究以地参三种五环三萜酸活性成分构建网络药理学，建立成分-疾病-靶点的关联网络，得出潜在作用靶标58个，根据这些靶标进一步收集三萜酸保肝作用过程及富集通路。

PPI网络及核心靶点排序中度值排名前三的关键靶点HSP90AA1、MAPK3、MAPK1与肝功能作用相关，HSP90系列是目前世界上性能最优越的肝癌标志物，可用于肝癌患者的病情监测和疗效评估[9]。MAPK是肝细胞内促细胞增殖和传递应激信号的关键激酶，肝IRI中的一个重要因子，MAPK在肝再灌注后迅速通过磷酸化被激活,参与诱导细胞凋亡坏死,肝纤维化也与MAPK有关[10-11]。GO生物学富集结果表明，前3位的富集过程包括negative regulation of apoptotic process、response to ethanol、response to toxic substance。通过KEGG富集分析,得到前5的信号通路为Pathways in cancer、Prostate cancer、Proteoglycans in cancer、Chemical carcinogenesisreceptor activation、Endocrine resistance。地参萜类保肝主要通过这些重要信号通路进行调控。用分子对接技术分析结果可得，HSP90AA1、MAPK1、MAPK3、SRC、EGFR靶点的结合能均＜-7.3 kcal/mol，说明萜类活性成分与靶点间结合力好，构象稳定。结合能越低，说明结合越稳定，其中HSP90AA1结合能力最佳。由试验结果分析，以微观的分子角度系统可预测分析地参三萜酸保肝的作用机制，对分析为其预防、修复肝脏功能等提供证据支持。

四、结论

综上所述，基于网络药理及分子对接技术，初步探究了地参三萜酸活性成分保肝可能的作用机制，为其对保肝临床应用的合理性、有效性、精准性提供理论依据，为地参中潜在活性成分后续研究奠定理论基础。网络药理学及分子对接理论性较强，对探究地参三萜酸成分的保肝作用机制有一定的限制性，筛选条件所限，仅对地参萜类有效成分及主要作用靶点进行了分析，已筛出萜类的靶标和途径，但其作用机理还需进一步进行实验验证。