HPLC 法测定新乐康片相关药材中8 种活性成分含量

邓雨荷，张庆林，杨明武，陈 伟，何 珺*

（1. 贵州大学药学院，贵州 贵阳 550025；2. 西南特色药用生物资源开发利用教育部工程研究中心，贵州 贵阳 550025；3. 山西太原药业有限公司，山西 太原 030021）

新乐康片，气味特异，味微酸；有着平肝养心安神的作用，适用于神经衰弱、证见失眠、烦躁等，是由钩藤、酸枣仁和萝芙木三味药材组成的中药复方片剂[1]。经文献查阅，钩藤及其制剂质量多以钩藤总生物碱或者钩藤碱含量作为评测指标[2-3]；酸枣仁中斯皮诺素和酸枣仁皂苷A 为发挥镇静、催眠作用的主要成分[4-5]；萝芙木中降压、镇静的主要成分是吲哚类生物碱，包含利血平、阿义吗啉、育亨宾等[6-7]。新乐康片原标准对钩藤碱进行薄层扫描法测定含量，但操作比较复杂，对于萝芙木利用沉淀法测总碱，而对于酸枣仁仅是做了薄层鉴别；这些含量测定和鉴别误差较大且不能有效控制片剂的内在质量。

现有报道中，关于钩藤中相关组分的测定，罗俊等[8]采用乙腈-0.1%三乙胺水溶液（1%磷酸调pH=9）进行梯度洗脱，覃春叶等[9]用含0.2 mg/mL乙酸铵的0.8 mg/mL 的磷酸氢二钠溶液-甲醇进行等度洗脱，而刘明[10]进行了甲醇和乙腈两个体系的筛选，最终选择乙腈-磷酸二氢钾体系进行测定；关于酸枣仁相关组分测定的报道，温子帅等[11]采用乙腈-水的流动相体系进行梯度洗脱，赵祥升等[12]采用乙腈-0.1%乙酸水进行梯度洗脱；有关萝芙木生物碱的测定，龙云惠等[13]采用甲醇-水（0.004 mol/L 二乙胺）进行等度洗脱，邓明等[14]和李文静等[15]在其基础上分别从洗脱梯度及水相组成进行了改进。基于对一系列文献的理解与总结，发现这三种药材相关组分的测定中柱型、温度和流速基本一样，流动相的组成上大致相似且存在互通的可能性。

本文在上述方法上，进行了流动相筛选、洗脱梯度调整以及检测波长筛选，利用HPLC 一法对新乐康片的三种原料中8 种活性成分进行同时测定，测定钩藤碱、异钩藤碱、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、斯皮诺素、利血平、育亨宾、阿义吗啉8 个有效成分，建立HPLC 法测定新乐康片三种原料中8 种活性成分的方法，为药业在生产新乐康片前期的药材选取以及片剂的质量控制方面提供参考。

1 实验

1.1 原料与试剂

钩藤，安徽毫州；酸枣仁，河北；萝芙木，云南丽江。

对照品：利血平，批号22060923，纯度≥98%，购于上海同田生物技术股份有限公司；阿义吗啉，批号HBWS220508-2，纯度≥97.1%，购于北湖北魏氏化学试剂股份有限公司；其余对照品均购于四川萃益润物技术股份有限公司（育亨宾，批号：CYRY0264221008，纯度≥98%；斯皮诺素，批号：CYRS0148201025，纯度≥98%；酸枣仁皂苷A，批号：CYR-S0008211118，纯度≥99%；酸枣仁皂苷B，批号：CYR-S0009220401，纯度≥99%；钩藤碱，批号：CYR-G0065220710，纯度≥99%；异钩藤碱，批号：CYR-Y0210220624，纯度≥99%）。

乙腈，色谱级，德国MWE-GK；甲醇、无水乙醇、磷酸、三乙胺均为分析纯；水，哇哈哈纯净水。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪，LC-2040C 3D，日本岛津制作所；数控超声波清洗器，KQ3200DE，昆山市超声仪器有限公司；电子天平，BSA1245S，赛多利斯科学仪器北京有限公司；恒温电热水浴锅，HH-1，常州华奥仪器制造有限公司；粉碎机，FSJ-A05N6，龙港市创达商贸有限公司；其他为一般常规仪器。

1.3 对照品溶液的制备

精密称取斯皮诺素5.760 mg、育亨宾8.270 mg、异钩藤碱7.750 mg、酸枣仁皂苷A8.840 mg、酸枣仁皂苷B 6.990 mg、利血平6.180 mg，用甲醇定容至10 mL；精密称取阿义吗啉5.720 mg用甲醇定容至5 mL；精密称取钩藤碱8.50 mg，用甲醇定容至100 ml。然后各吸取1 mL制备混合标准溶液，备用。

1.4 供试品溶液的制备

精密称取钩藤粉末2.0 g，置于50 mL锥形瓶中，加入4 mL氨试液（氨水∶水∶乙醇=9∶30∶16）碱化30 min，再加入80 mL氯仿混匀后超声处理80 min，滤过，回收溶剂至干，残渣置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得钩藤供试品溶液。

精密称取酸枣仁粉末1.0 g置于索氏提取器中，加石油醚适量，加热回流4 h，滤过至干，得脱脂后的药材粉末。取上述药材粉末适量，以料液比1∶10 加70%乙醇溶液，加热回流2 h，滤过，回收溶剂至干，残渣置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得酸枣仁供试品溶液。

精密称取萝芙木粉末5 g左右，加75%乙醇50 mL，加热回流1 h，过滤，连续两次，合并提取液，回收溶剂至干；残渣置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得萝芙木供试品溶液。

1.5 色谱条件

色谱柱，Titank C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温，30℃；检测波长，204 nm；流速，1.0 mL/min；进样量，10 μL。柱温，30℃；检测波长，204 nm；流速，1.0 mL/min；进样量，10 μL。

流动相A为乙腈，B为0.4%磷酸水溶液（含0.05%三乙胺）。梯度洗脱：0.01～10 min，20%～25%A；10～20 min，25% A；20～25 min，25%～40% A；25～35 min，40% A ；35～50 min，40%～70% A；50～51 min，70%～90% A；51～55 min，90% A；55～60 min，90%～20% A；60～65 min，20% A。

2 结果与讨论

2.1 系统适应性理论分析和实验

测定的8 种活性成分主要分为生物碱和皂苷两个大类，针对本实验的两大类物质的结构之间差异较大，在液相测定中两类成分基本上能互不干扰。

对于固定相与柱长，进行了Titank C18、Diamonsil C18、E clipse Plus C18 以及氨基柱的筛选，固定相为Titank C18 时分离度更好且理论塔板数能达要求；柱长的筛选，短柱的出峰早，但峰分离度低，因此最终选择Titank C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

流动相和波长选择上，根据甲醇的最大吸收波长为210 nm，乙腈的最大吸收波长为190 nm，酸枣仁皂苷A和B的最大吸收在204 nm，生物碱在200～280 nm均有紫外吸收，考虑到甲醇在低波长处有较强的末端吸收，为减少干扰并提高信噪比，同时兼顾皂苷的吸收波段，故选择乙腈为有机相、波长为204 nm；水相选择上，由于皂苷类化合物在中性或碱性条件下易发生电离，需采用磷酸调整流动性的酸碱性，而生物碱通常为碱性，测定时因硅胶表面的硅羟基对碱性物质的吸附，容易产生拖尾现象，故流动相水相中考虑加入三乙胺作为扫尾剂，最终确定流动相为乙腈和0.4%磷酸水溶液（含0.05%三乙胺）。针对流速的选择上，设定了多个不同流速，1.0 mL/min流速虽缩短了保留时间，但各分峰分离效果较差且使色谱柱压力增大，0.6mL/min延长了保留时间，但分离效率却不高，故流动相流速选择0.8 mL/min。进而得到1.5 所对应的色谱条件。

分别取1.3 与1.4 配制的标准溶液和供试品溶液，按1.5 所对应的色谱条件进行测定，色谱图见图1。由图可知，测定的混合对照品色谱峰与测定的钩藤、酸枣仁及萝芙木相关活性成分色谱峰均有良好的分离度，中药材品溶液中各成分有少数无干扰，表明该方法专属性均良好。

图1 混合对照品、钩藤、酸枣仁、萝芙木的色谱图

2.2 线性关系考察

将1.3 配制好的系列混合标准溶液，混合标准溶液中各组分的浓度如表1；用0.45 μm微孔过滤膜过滤后放入样品瓶中，准备上机检测。按1.5 所设定的色谱条件，进样量为10 μL，做高效液相色谱分析，以对照品的浓度C（mg/mL）为横坐标，峰面积A为纵坐标，绘制标准曲线，作线性回归。结果表明斯皮诺素、育亨宾、阿义吗啉、异钩藤碱、钩藤碱、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、利血平8 种活性成分分别在各自的线性范围内线性关系良好，线性回归方程与线性范围见表2。

表1 8 种成分的浓度

表2 8 种成分的线性关系考察结果

2.3 仪器精密度试验

按照1.4 制备钩藤、酸枣仁及萝芙木的样品溶液各1 份，对其中8 种活性成分进行含量测定，按1.5 的色谱条件进行分析，连续进样6 次（n=6），每次进样量均为10 μL，通过HPLC响应值计算相对标准偏差值（RSD）。结果显示，钩藤中钩藤碱和异钩藤碱的RSD依次为1.08%、0.54%；酸枣仁中斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B的RSD依次为1.29%、0.98%、1.36%；萝芙木中阿义吗啉、育亨宾、利血平的RSD依次为1.23%、1.02%、1.94%，RSD＜2%；三味药材的相关活性成分的相对标准偏差均小于2%，可知本实验所用仪器精密度良好。

2.4 稳定性试验

取1.4 处理的供试品溶液，在1.5 色谱条件下，测定室温下放置0、4、8、12、24、48 这6 个时间段的供试品溶液，记录峰面积。数据显示12 h内钩藤中钩藤碱和异钩藤碱的RSD依次为1.93%、0.72%，RSD均小于2%，而48 h内峰面积RSD异钩藤碱为1.29%，钩藤碱为3.15%，表明钩藤样液在12 h内稳定。酸枣仁样液在48 h内斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B的RSD依次为1.57%、0.95%、1.98%，RSD均小于2%，表明酸枣仁供试品溶液在48 h内稳定。萝芙木样液在24 h内阿义吗啉、育亨宾、利血平的RSD依次为0.93%、1.13%、1.97%，而48 h内阿义吗啉、育亨宾、利血平的峰面积RSD依次为4.29%、2.98%、4.83%，表明萝芙木样液在24 h内稳定。

2.5 样品重复性试验

按照上述相关试验方法平行制备钩藤、酸枣仁及萝芙木的样品溶液各6 份，分别按1.5 色谱条件进行上机，每次进样量均为10 μL，通过HPLC响应值计算相对标准偏差值（RSD），结果表明药材中均含有测定的相关活性成分，钩藤中钩藤碱和异钩藤碱的RSD依次为1.06%、0.56%；酸枣仁中斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B的RSD依次为0.62%、1.11%、0.98%；萝芙木中阿义吗啉、育亨宾、利血平的RSD依次为1.06%、1.24%、1.56%；由三味药材中八种组分的RSD均小于2%，可知本实验样品重复性良好。

2.6 回收率试验

各取已知浓度钩藤样液8 mL、酸枣仁样液2 mL、萝芙木样液5 mL，按100%添加量加入8 种对照品溶液混合摇匀，采用本文1.5 色谱条件进行上机分析，根据响应值，计算平均回收率与相对标准偏差（RSD），结果显示见表3。

表3 8 种活性成分加标回收率（n=3）

2.7 含量测定

按本文1.4 的条件制得钩藤、酸枣仁及萝芙木供试品溶液，吸取适量待测液，采用1.5 的色谱条件测定药材相关组分的含量，本次实验所得的HPLC色谱图如图1。其含量测定结果见表4。

表4 药材中8 种成分的含量测定（±s，n=3）

表4 药材中8 种成分的含量测定（±s，n=3）

药材 组分 含量/(μg/g)钩藤 钩藤碱 11.46±0.5异钩藤碱 62.61±0.6斯皮诺素 705.90±1.5酸枣仁酸枣仁皂苷A 1709.85±6.3酸枣仁皂苷B 31.70±0.7阿义吗啉 62.68±1.1萝芙木育亨宾 11.86±0.4利血平 211.29±1.8

3 结论

本文建立了HPLC测定钩藤、酸枣仁及萝芙木中8 种活性成分的含量检测方法。由于中药混合制剂成分复杂，本文采用一法多测对新乐康片的三味药材进行主要有效成分的测定，对分离度要求较高，本文的色谱条件从多个维度进行了考察；其中对流动相的选择上考虑到新乐康片相关药材中生物碱类成分多，其通常为碱性，在进样分析时，由于硅胶表面的硅羟基对碱性物质吸附，容易产生拖尾现象，因此在考虑流动相水相时加入0.50%三乙胺作为扫尾剂。结果表明流速为1.0 mL/min，柱温为30℃、流动相体系为乙腈-0.4%磷酸水溶液（含0.05%三乙胺）、梯度洗脱、检测波长为204 nm时，分离效果良好，响应值较高。在该色谱条件分离效果较好，方法学验证结果表明仪器精密度良好，测量结果准确、高效。

综上所述，本文为三味药材中8 种相关活性成分测定建立了一种准确、快速、高效的检测方法，为生产新乐康片前期选材上节约了测定时间，提高了生产效率，同时为新乐康片中活性成分HPLC 含量测定方法建立及其质量标准升级提供参考。