溶酶体相关膜蛋白3通过VEGF/AKT通路抑制PC-3细胞增殖、转移及血管生成

陈灿伟 廖壮文 范子文 黄帅 黄彦 陈斌伟

广州医科大学附属第二医院骨科（广州 510260）

前列腺癌（prostate cancer， PCa）是男性第二大的恶性肿瘤之一，合并骨转移是PCa 患者的主要死因，研究发现原发性PCa 患者的5 年相对生存率为99%，而远处骨转移灶患者的5 年相对生存率不超过30%。此外，当PCa 转移到骨后会引起包括高钙血症、顽固性剧烈疼痛、病理性骨折或神经压迫综合征等相关并发症［1-3］。溶酶体相关膜蛋白3（lysosome-associated membrane protein 3，LAMP3）是一种调控肿瘤细胞溶酶体功能的特异性膜蛋白，LAMP3 在骨肉瘤、卵巢癌、直肠癌及食管癌中发挥重要调控作用，但国内外关于LAMP3在PCa 骨转移的研究目前尚未见报道［4-7］。因此本研究将重点探索LAMP3 对PCa 骨转移细胞的影响及机制，为其作为潜在的治疗靶点之一提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料人PC-3细胞购于ATCC细胞库，HUVEC细胞及ECM 培养基购于ScienCell 公司，RPMI-1640 培养基、胎牛血清双抗购自美国Gbico 公司；Matrigel 基质胶购自美国BD Biosciences 公司，CCK8 试剂盒购自美国AbMole 公司；单克隆体体LAMP3、VEGF、GAPDH 均购自美国Elabscience 公司，cyclin D1、c-myc、p-AKT、AKT 购自美国CST 公司，BCA 蛋白检测试剂盒、ECL 发光液购于碧云天公司，ELISA 检测试剂盒购自美国 R&D system，Trizol 购于美国Invitrogen 公司，Prime ScriptTMRT Master Mix 试剂盒、SYBR®Select Master Mix 试剂盒购于日本Takara 公司。

1.2 细胞转染将PC-3 细胞以1 × 105个/孔的密度接种至6 孔平板中，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养至70%时，使用Lipofectamine 3000 转染试剂将Vector 及LAMP3-siRNA（序列如下5'-CACGAUGGCAGUCAAAUGATT-3' 和5'-UCAUUUGACUGCCAUCGUGTT-3'）质粒转染入PC-3 细胞中，继续在37 ℃、5% CO2培养箱中培养，转染48 h后添加G418继续筛选，24 h 后停止筛选继续培养及传代。

1.3 CCK-8 检测细胞增殖将转染后的PC-3 细胞制成单细胞悬液并以4 × 103个/孔接种至96 孔板，贴壁后每孔加入100 μL CCK8稀释液（含10 μL CCK8 原液），孵育2 h 后在490 nm 波长处测定细胞吸光度，设置5 个副孔并重复3 次。

1.4 划痕试验将转染后的细胞按1 × 105个/孔接种至6 孔板中，待细胞汇合到80%时用200 μL无菌移液器尖端划痕，培养基洗涤后继续培养，24 h 后通过使用显微镜拍照并使用Image J 软件测量和计算间隙宽度。

1.5 Transwell 实验用无血清培养基将转染的PC-3 细胞重悬后，以5 × 105个/孔的密度接种至Transwell 上室中，下室加入含20% FBS 的培养基，继续培养24 h 后用4%多聚甲醛固定10 min，PBS清洗2 次用0.1%结晶紫染色20 min，拍照后随机选择5 个视野计数。

1.6 条件培养液制备及血管分化试验取转染si-LAMP3 后继续培养2 代的PC-3 细胞，胰酶消化后分瓶培养至70 %时各取培养液6 mL，3 000 r/min离心15 min后收集上清液，制备条件培养基Vector-CM 及LAMP3-CM，使用孔径为0.22 μm 的滤过膜滤过后-20 ℃冰箱保存备用。血管分化在Matrigel基质胶上进行，将预冷的Matrigel 胶预涂至96 孔板上并放入培养中聚合30 min，然后HUVEC 细胞以1 × 104个接种至培养孔中，然后分别每孔加入100 μL 上述条件培养基。24 h 后在显微镜下拍照并进行计数分析。

1.7 ELISA使用 ELISA 检测试剂盒定量测定条件培养基中的MMP9 和VEGF 表达，根据说明书检测 TGF-β1 和 VEGF 的表达，使用96 孔酶标仪在450 nm 处进行检测，每个检测组设置4 个副孔，结果取平均值并表示为 pg/mL。

1.8 RT-qPCR提取细胞总RNA，用逆转录试剂盒以1 μg 经RNase 活性的DNA 酶预处理的RNA作为模板制备cDNA 文库，然后使用实时PCR 试剂盒进行PCR扩增共40个循环。以GAPDH作为对照，通过2-ΔΔCq法计算LAMP3、VEGF、AKT 及p-AKT的mRNA 表达量。

1.9 Western blot将离心后的细胞PBS 洗涤后加入含有PMSF 和RIPA 的裂解液提取总蛋白，使用BCA 法测定蛋白浓度。将样品在10%的SDSPAGE 中电泳2 h，PVDF 膜电转1.5 h 后用5%脱脂牛奶中封闭60 min。将PVDF 膜放在相应的一抗（1∶1 000）中过夜孵育。摇床低速震荡1 h 后TBST洗膜液洗涤3 次，放入二抗（1∶5 000）中低速震荡1 h，孵育完成后TBST 液洗涤3 次，然后用ECL 发光液曝光条带。

1.10 统计学方法数据由SPSS 进行统计分析和GraphPad 作图，计量资料表示为均数±标准差，使用t检验评估组间差异，检验水准为α = 0.05，P ＜0.05 被认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LAMP3 在PCa 细胞中的表达高于前列腺上皮细胞PCa 细胞LNCaP、C4-2B 及PCa 骨转移细胞PC-3 中LAMP3 的表达水平明显高于前列腺上皮细胞REPE-1，且PCa 骨转移细胞PC-3 中LAMP3的表达水平最高（P ＜0.05，图1）。

图1 PCa 细胞与正常细胞中LAMP3 的表达水平Fig.1 The expression levels of LAMP3 were determined in prostate cancer cells compared with normal prostate epithelial cells

2.2 LAMP3 抑制PC-3 细胞的增殖我们构建了稳定沉默LAMP3 的PC-3 细胞，WB 结果表明成功沉默PC-3 细胞中LAMP3 基因表达，下调LAMP3能抑制与细胞周期相关的基因cyclin D1、c-myc 的表达（图2A）。进一步检测LAMP3 对PC-3 细胞增殖的影响，结果发现与对照组及空载对照组相比，沉默LAMP3 明显抑制PC-3 细胞的增殖能力（P＜0.01，图2B）。

图2 沉默LAMP3 抑制PC-3 细胞的增殖Fig.2 LAMP3-silencing inhibited the cell proliferation of PC-3 cells

2.3 LAMP3 抑制PC-3 细胞的迁移与对照组及空载组相比，沉默LAMP3 的PC-3 细胞培养24 h后，细胞的迁移能力明显被抑制（P ＜0.01，图3）。

图3 沉默LAMP3 抑制PC-3 细胞的迁移亡（× 50）Fig.3 LAMP3-silencing inhibited the cell migration of PC-3 cells

2.4 LAMP3 抑制PC-3 细胞的侵袭为了探索LAMP3 对PC-3 细胞侵袭的影响，我们使用了Transwell试验进行检测，结果表明与对照组及空载对照组相比，沉默LAMP3的PC-3细胞培养24 h后，PC-3细胞的侵袭能力明显被抑制（P ＜0.01，图4）。

图4 沉默LAMP3 抑制PC-3 细胞的侵袭（× 50）Fig.4 LAMP3-silencing inhibited the cell invasion of PC-3 cells

2.5 LAMP3 抑制血管生成因子表达及血管生成为了探索LAMP3 对肿瘤诱导血管生成的影响，我们用沉默LAMP3 的PC-3 细胞制备的条件培养基si-LAMP3-CM 处理HUVEC 并在Matrigel 基质胶模型中培养，结果发现LAMP3 抑制了HUVEC的血管生成（图5A），ELISA 结果也表明条件培养基si-LAMP3-CM 中血管内皮生长因子VEGF、MMP9 的分泌明显减少（P ＜0.05，图5B-D）。

图5 沉默LAMP3-CM 抑制MMP9、VEGF 表达及HUVEC 细胞的血管生成（× 50）Fig.5 Angiogenesis of HUVEC and the expression of both VEGF and MMP9 is inhibited under si-LAMP3-CM

2.6 LAMP3 通过下调VEGF/AKT 通路抑制LAMP3 的促血管生成作用为了探索LAMP3 对血管生成影响的分子机制，我们检测了条件培养基si-LAMP3-CM 处理HUVEC 后相关分子的表达，结果表明LAMP3 抑制了VEGF 的表达，并下调AKT 的磷酸化，提示LAMP3 通过下调VEGF/AKT抑制了HUVEC 的血管生成（P ＜0.05，图6）。

图6 LAMP3 抑制PC-3 细胞的VEGF 及AKT 通路的表达Fig.6 LAMP3 inhibited the expression of VEGF and AKT signaling pathway in PC-3 cells

3 讨论

前列腺癌是全球男性常见的恶性肿瘤之一，远处骨转移是PCa 患者死亡的主要原因，尽管局部PCa 的治疗取得了实质性进展，但转移性PCa仍无法治愈，因此探索PCa 转移的潜在机制对于寻找PCa 骨转移的预防或治疗策略至关重要［8-9］。LAMP3 作为一种溶酶体相关膜蛋白，最初发现其参与感染反应过程中成熟树突细胞 （CD208、DCLAMP）的抗原呈递，是形成溶酶体和维持溶酶体功能的关键蛋白［10-11］。此外，LAMP3 还与细胞自噬密切相关，如可通过诱导溶酶体膜透化或组织蛋白酶重分布而引发细胞自噬性死亡［12-14］。最近的研究表明LAMP3 作为一种肿瘤相关特异性蛋白与肿瘤迁移、侵袭及耐药有关，WU 等［15］发现与邻近的正常组织相比，LAMP3 在喉部鳞状细胞癌组织中的表达显著升高，体内外研究表明LAMP3可调控LAMP3/LAMC2/TNC通路抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭，且LAMP3 与喉癌患者的不良预后相关。LIU 等［16］发现下调LAMP3 能增加抑癌基因TP53 在骨肉瘤细胞中的表达并促进骨肉瘤细胞凋亡，抑癌基因TP53是LAMP3下游的关键调控基因。在本研究中，我们通过PCR及WB实验发现了LAMP3在PCa 细胞中的表达明显高于正常前列腺上皮细胞，其中以PC-3 及C4-2B 细胞上调最为明显。随后我们构建了siRNA 以抑制LAMP3 在PC-3 细胞的表达并进行了细胞增殖试验、划痕试验及Transwell 试验，结果发现下调LAMP3后PC-3的增殖、迁移和侵袭能力均明显被抑制，与其他LAMP3 调控肿瘤的研究结果相似，该结果提示LAMP3 可能在PCa 骨转移中起重要调控作用。

肿瘤诱导的异常血管生成是肿瘤快速发生发展的病理基础，在肿瘤细胞增殖过程中会分泌大量促血管生成因子并募集内皮细胞形成异常的新生血管，这些新生血管会诱发缺氧微环境以促进肿瘤细胞的侵袭并阻碍免疫细胞的杀伤，因此肿瘤诱导的新生血管是肿瘤转移的关键因素和治疗靶点［17-19］。Matrigel 基质已广泛应用于体外研究血管内皮细胞的血管生成，其主要是通过Matrigel 基质胶构建生物培养平台，以模拟血管内皮细胞在组织间的迁移和诱导形成管状血管样结构，在体外可根据小管形成率和管样结构评估血管生成效果［20-21］。在本研究中，我们首先收集了沉默LAMP3 后PC-3细胞的上清液并制备成条件培养基LAMP3-CM，然后利用Matrigel 培养平台在体外检测了条件培养基LAMP3-CM 对HUVEC 细胞血管生成的影响，结果表明条件培养基LAMP3-CM 可明显抑制HUVEC 细胞的血管生成，与对照组相比LAMP3-CM组HUVEC 细胞的血管样小管数量明显减少，该结果提示LAMP3 可能是抑制PC-3 细胞诱导血管生成的靶点之一。

研究发现多种关键生成因子和信号通路调控肿瘤诱导的血管生成，其中由血管内皮生长因子VEGF 及AKT 信号通路尤为重要［22-23］。AKT 信号通路中多个基因是诱导血管生成和维持血管通透性的重要分子，如VEGF、HIF-1α 与MMP9 是调节血管生成的关键基因，在多种基因和细胞因子的诱导下会刺激内皮细胞增殖并诱导形成新血管［24-25］。DUAN 等［26］在发现穿心莲内酯可能通过激活PI3K/AKT-eNOS 信号通路传导参与调节高糖诱导的血管内皮细胞损伤模型中的血管生成。YU 等［27］发现山奈酚通过下调VEGF/AKT 信号通路以抑制LPS 和TNF-α 诱导的大鼠肠道血管内皮细胞的炎症反应，同时AKT 和VEGF 形成自分泌回路来调节内皮细胞的血管生成。在本研究中，我们的结果表明LAMP3 不仅下调了PC-3 细胞中VEGF 的分泌和表达，同时下调了AKT 的磷酸化水平从而抑制了血管内皮细胞的血管生成。

综上所述，LAMP3 通过下调VEGF/AKT 通路抑制PC-3 细胞的增殖、迁移、侵袭及血管生成，表明LAMP3 对PCa 的进展具有重要的调控作用，但该结果仅为体外实验结果，LAMP3 对其他PCa 细胞如C4-2B 的影响及其在体内的抑制作用尚未探索，因此下一步将在体内进一步验证其抗瘤活性，为LAMP3 作为新的PCa 转移瘤治疗靶点提供实验依据。

【Author contributions】CHEN Canwei wrote the article. CHEN Canwei， LIAO Zhuangwen and FAN Ziwen performed the experiments.HUANG Shuai and HUANG Yan collected data. CHEN Binwei designed the study. All authors read and aplproved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.