结合外周血微RNA-181b表达水平探讨急性脑梗死病人侧支循环形成的影响因素

刘相城，付宏，刘春柏，张爽，胡姣月，鲍金，赵增霞，罗翰，符鹏程，刘淑云

作者单位：深圳市龙华区中心医院神经内科，广东 深圳 518110

急性脑梗死（acute cerebral infarction，ACI）是神经功能损伤临床综合征，主要由脑部血液供应障碍导致大脑缺血缺氧引起［1］，具有较高的发病率和致残率［2］。研究表明，ACI 的发生、发展及预后与脑动脉侧支循环的形成和开放密切相关［3］，脑动脉侧支循环的形成能够促使缺血区域恢复血供，从而降低梗死面积，起到保护脑组织的作用［4］。因此，预测脑动脉侧支循环形成情况，在指导ACI 病人临床治疗过程中扮演着极其重要角色。微RNA（miRNA，miR）属于短链非编码RNA，在真核生物中具有调控功能，包含21～23 个核苷酸序列，可与目标基因mRNA 的3’非翻译区（UTR）碱基配对结合［5］，参与调控机体多种生物学功能。miR-181b 隶属于miR-181 家族成员，可调控心血管组织细胞中细胞因子、蛋白酶及相关受体的基因表达，参与心血管疾病的病理过程［6］。因此本研究主要探讨miR-181b在早期ACI病人外周血中的表达情况及其表达与病人脑侧支循环形成的相关性，分析ACI 病人侧支循环形成的影响因素，以期为ACI 的临床治疗提供理论指导。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2015 年6 月至2019 年5 月在深圳市龙华区中心医院神经内科住院治疗的行数字减影血管造影（DSA）检查符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2018》［7］诊断标准的ACI 病人175例作为研究对象，男性129 例，女性46 例，病人年龄（58.17±17.96）岁，范围为29～85 岁。纳入标准：（1）纳入病人初次发病，且在24 h 内入院治疗；（2）纳入病人均经核磁共振成像或CT 检查证实存在责任病灶；（3）就诊前2个月病人未服用过他汀类以及促红细胞生存素药物。排除标准：（1）出血性脑疾病、脑血管畸形或合并动脉炎者；（2）伴随有严重脏器功能障碍的病人；（3）伴随有恶性肿瘤、感染及凝血障碍病人；（4）已接受溶栓或取栓治疗者；（5）进展性脑梗死、心源性脑梗死或脑梗死后出血转化者。纳入研究对象均签署知情同意书，获深圳市龙华区中心医院伦理委员会批准（批号2015-283-06）。

1.2 临床资料收集病人临床资料通过查阅电子病历获得，包括病人的性别、年龄、吸烟史、冠心病史、糖尿病史、高血压史、饮酒史等。入院后，等病人平稳状态测量血压记录收缩压和舒张压。入院后次日清晨，空腹（空腹时间在8 h 以上）采集肘静脉血5 mL，离心获得血清（离心条件：3 000 r/min，半径10 cm，15 min），检测总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、空腹血糖、血同型半胱氨酸（Hcy）、血尿酸、血浆纤维蛋白原（FIB）及C 反应蛋白（CRP）及白细胞计数。其中高血压定义：既往高血压病且正在服用降压药或者血压≥140/90 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）；吸烟者定义：目前吸烟或者戒烟不足1个月。

1.3 方法

1.3.1 脑血管造影检查病人入院第5天行DSA检查。局麻后行股动脉穿刺，选择改良Seldinger 穿刺术，穿刺成功后将5F 或8F 动脉鞘置入，静脉推注肝素2 500 U，然后在主动脉弓中将导丝和5F pigtail导管置入，注射造影剂（碘普罗胺），行主动脉弓造影，观察主动脉弓及弓上大血管结构，确认无斑块或狭窄，进行后续操作。pigtail导管从中拔出，然后将5F椎动脉导管分别置于双侧颈总动脉、颈内动脉、外动脉及椎基底动脉，注射碘普罗胺，分别行上述动脉正位、侧位及颅内DSA检查。

1.3.2 脑梗死体积测定病人行DSA 后，进行头部CT 检查，测量低密度灶的长宽厚3 径，然后计算脑梗死灶体积（cm3）=长×宽+CT扫描阳性层数×π/6，若有多个病灶，累加总体积即为脑梗死体积。

1.3.3 定量逆转录PCR（quantitative reverse transcription PCR， RT-qPCR）采用RT-qPCR 法检测血清miR-181b 表达水平，采用Trizol 试剂盒（美国Invitrogen 公司）和miRNeasy Mini Kit 试剂（德国Qiagen 公司）盒提取血清总miRNA，NanoDrop 2000超微量核酸测定仪检测miRNA 浓度，取2 μg检验合格的血清miRNA 采用逆转录试剂盒将miRNA 逆转录为互补DNA（cDNA），以cDNA 为模板采用SYBR Gene RealtimePCRMaster Mix 进行实时荧光定量PCR 反应。miR-181b 正向引物：5'-AACATTCATTGCTGTCGGTGGG-3'，反向引物：5'-GCGAGCACAGAATTAATACGACTCAC-3'；U6 正向引物：5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，反向引物：5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。RT-qPCR 在7500实时荧光定量PCR 系统中进行，反应设置如下：95 ℃预变性30 s，95 ℃ 30 s，60 ℃ 34 s，74 ℃ 30 s，38个循环，反应均以U6 为内参，采用2-ΔΔCt算法计算miR-181b的相对表达量。

1.4 评估标准

1.4.1 神经功能缺损评分神经功能采用美国国立卫生研究院卒中量表（NIHSS）评估：NIHSS 评分≤6 分为轻度神经功能损伤；7～14 分为中度神经功能损伤；≥15分为重度神经功能损伤。

1.4.2 血管狭窄程度判定标准颈动脉狭窄程度计算：采用北美症状性颈动脉内膜切除试验［8］，即：狭窄率（%）=（1-最狭窄动脉管径/正常动脉管径）×100%。狭窄程度分级：0＜狭窄程度≤29%为轻度狭窄；29%＜狭窄程度≤69%为中度狭窄；69%＜狭窄程度＜100%为重度狭窄；狭窄程度=100%为闭塞。

1.4.3 侧支循环形成及血流分级标准［8］前交通动脉开放标准：一侧颈内动脉造影见对比剂经前交通动脉显影对侧大脑前、中动脉主干及分支；后交通动脉开放标准：椎动脉造影显示造影剂通过后交通动脉显影了颈内动脉主干和分支；吻合侧支循环开放标准：包括软脑膜动脉和眼动脉，经一支动脉的分支或主干通过另一支动脉的尖端逆行形成。

侧支循环的开放途径分为3 个等级［9］。一级：依靠Willis 环的血流代偿实现侧支循环，包括前、后交通动脉；二级：依靠眼动脉、软脑膜吻合支及其他相对较小的侧支与侧支吻合支之间的血流代偿实现侧支循环；三级：新生血管形成。侧支循环血流灌注分级，采用美国放射介入学会（ASITN/SIR）的侧支循环评估系统：0 级，完全无侧支血流供应；l级，非梗死区域血流缓慢灌注；2 级，非梗死区域血流快速灌注；3 级，梗死区域血流缓慢灌注；4 级，梗死区域血流快速灌注。侧支血流0～2级纳入侧支循环不良组，侧支血流3～4级纳入侧支循环良好组。

1.5 训练集与测试集分组将175例ACI病人按照3∶1 的比例，采用计算机产生随机数分为训练集（129 例）和测试集（46 例），分别用于构建侧支循环形成不良预测模型和验证模型预测效能。两组病人性别、年龄、身体质量指数和侧支循环形成不良比例比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 训练集与测试集ACI病人一般临床资料比较

1.6 统计学方法数据分析采用SPSS 23.0 统计软件。定性资料使用百分数（%）表示，组间比较采用χ2检验。正态分布定量资料以表示，两组间比较采用两独立样本t检验；非正态分布定量资料以中位数（第25、75百分位数）［M（P25，P75）］表示，两组间比较采用Mann-WhitneyU检验。使用Spearman相关性分析检验ACI 病人血清miR-181b 表达与侧支循环形成的相关性。脑侧支循环形成不良因素分析采用logistic 回归模型。以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ACI 病人临床资料及侧支循环形成情况训练集中侧支循环形成良好病人90例，侧支循环形成不良病人39例。单因素分析结果显示，两组病人性别、年龄、糖尿病史、饮酒史、病变位置、总胆固醇、收缩压、舒张压、三酰甘油、LDL-C、FIB、CRP 和白细胞计数比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。侧支循环良好组吸烟比例、总胆固醇、高血压比例、空腹血糖、Hcy、血尿酸、冠心病比例、梗死体积均显著低于侧支循环形成不良组，而脑血管重度狭窄或闭塞病人比例以及miR-181b 相对表达量显著高于侧支循环形成不良组，均差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 训练集129例ACI病人侧支循环形成良好和不良组一般临床资料比较

2.2 不同侧支循环代偿ACI病人血清miR-181b表达水平及NIHSS 评分训练集无侧支循环开放病人17 例（13.18%），存在侧支循环的病人112 例（86.82%），其中一级侧支循环开放病人54 例（41.86%），仅前交通动脉开放者14 例（10.85%），仅后交通动脉开放者17 例（13.18%），前、后交通动脉均开放者23 例（17.83%）；二级侧支循环开放病人35 例（27.13%），其中软膜动脉代偿20 例（15.50%），眼动脉代偿15 例（11.63%），三级代偿病人23 例（17.83%）。和无代偿组相比，血清miR-181b水平在一级代偿组、二级代偿组、三级代偿组ACI病人呈现逐步升高趋势，而NIHSS 评分在三组中呈现逐步下降趋势，均差异有统计学意义（均P＜0.01），见表3。

表3 训练集129例不同侧支循环开放类型病人血清miR-181b水平及NIHSS评分比较/

表3 训练集129例不同侧支循环开放类型病人血清miR-181b水平及NIHSS评分比较/

注：NIHSS为美国国立卫生研究院卒中量表。

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2.3 ACI 病人脑侧支循环形成不良的影响因素将单因素分析中具有显著性的因素按表4 进行赋值，采用似然比前进法对变量进行筛选，然后纳入非条件logistic 多因素分析，结果显示，高血压史、Hcy、后循环病变均为脑梗死病人侧支循环形成不良的独立危险因素；miR-181b 相对表达量和脑血管狭窄程度为侧支循环形成不良的保护因素，见表5。

表4 ACI病人129例侧支循环形成不良影响因素赋值量表

表5 训练集129例ACI病人侧支循环形成不良多因素分析

2.4 血清miR-181b 水平与病人侧支循环形成的相关性分析Spearman 相关性分析结果显示，血清miR-181b 表达水平与ACI 病人脑侧支循环形成情况呈显著正相关（r=0.77，P＜0.001）。

2.5 ACI 病人侧支循环形成不良的预测模型建立根据logistic回归分析结果，侧支循环形成不良预测值=EXP［0.491-1.914（高血压史）-1.409（Hcy）+2.145（miR-181b 相对表达量）-1.286（后循环病变）+0.594（脑血管狭窄程度）］/1+EXP［0.491-1.914（高血压史）-1.409（Hcy）+2.145（miR-181b 相对表达量）-1.286（后循环病变）-0.594（脑血管狭窄）］。该模型曲线下面积（AUC）为0.88［95%CI：（0.84，0.92）］。测试集ACI病人侧支循环形成不良预测模型AUC为0.80［95%CI：（0.76，0.88）］。两组病人AUC 比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

ACI 是临床常见的脑卒中类型，是一种常见的脑部血液循环障碍类疾病，其发病原因主要是脑供血血管的狭窄或闭塞，而侧支循环形成可以在一定程度上改善缺血部位供血，从而发挥保护脑组织的功能［10］。伴随着我国老龄化加剧以及饮食结构的改变，ACI 发病率呈现逐年递增趋势。miRNA 可调控蛋白表达并具有较高的稳定性，在血管内皮细胞增殖、凋亡等生物学过程中扮演重要角色发挥作用［11］。miR-181b 为内源性短小RNA，参与动脉粥样硬化、心肌纤维化、主动脉瓣膜病等疾病的病理过程。祁缘、荆黎［6］的研究表明认为miR-181b 在心血管疾病的调控过程中扮演着极其重要角色。刘振等［12］的研究发现，沉默LncRNA SNHG7 通过调控可通过调控miR-181b表达参与到心肌损伤修复过程。以上结果提示miR-181b 参与调控心血管疾病的病理过程，但miR-181b 在ACI 病人外周血中的表达及其表达水平与脑侧支循环形成的关系还鲜有报道。

本研究排除性别、年龄等一般临床资料的影响后发现，侧支循环形成不良组血清miR-181b相对表达量显著低于侧支循环形成良好组。通常将脑侧支循环分为三级：当脑动脉发生狭窄或闭塞时，Willis 环即前、后交通动脉开放，此时新建立的侧支循环可以帮助脑动脉系统向患侧供应血液，然而如果一级代偿无法提供足够代偿时，软膜动脉、眼动脉及其他较小的侧支代偿成为二级代偿，三级代偿指脑缺血或梗死区域周围形成新生血管［13］。本研究结果表明，一级侧支循环开放率（41.86%）显著高于二级代偿（21.73%）和三级代偿（17.83%），提示一级侧支循环开放为ACI病人脑动脉狭窄或闭塞时的主要代偿方式。和无代偿组相比，血清miR-181b水平在一级代偿组、二级代偿组、三级代偿组当中呈现逐步增加的趋势，而NIHSS 评分则在三组当中呈现逐步下降趋势。Spearman 相关性分析结果显示，血清miR-181b 表达水平与脑侧支循环形成情况呈显著正相关，上述结果表明血清miR-181b水平高低与ACI病人侧支循环形成良好程度关系密切。

众所周知，脑侧支循环的形成过程当中会受到多种因素影响，本研究单因素分析结果显示，吸烟、总胆固醇、空腹血糖、高血压史、Hcy、血尿酸、梗死体积、冠心病史、血清miR-181b 表达水平及脑血管重度狭窄程度均为ACI病人侧支循环形成不良的影响因素，随后将单因素分析P＜0.05 的指标纳入到多因素logistic 模型当中分析，结果发现miR-181b相对表达量、脑血管狭窄程度为ACI 病人侧支循环形成不良的保护因素，高血压史、Hcy、后循环病变为ACI病人侧支循环形成不良的独立危险因素，因此在临床实际工作当中，应该时刻关注病人的miR-181b水平、脑血管狭窄程度、高血压史、Hcy、后循环病变情况，提前干预，做好预防。研究表明，高血压对软脑膜侧支重塑具有抑制作用，不利于侧支循环形成［14］。Hcy 为敏感的炎性因子，可释放大量氧自由基及过氧化物，对人体抗氧化机制产生抑制作用，高Hcy 水平是心脑血管病的危险因素［15-16］。与前循环病变比较，后循环病变时侧支循环开放的途径较少，因此后循环病变ACI 病人更容易侧支循环形成不良［17］。脑血管狭窄是脑侧支循环形成的重要影响因素［18］，脑血管轻度或中度狭窄时，脑组织依靠自身弹性及神经调节恢复缺血区血流，侧支循环代偿较少，重度狭窄或闭塞时，低灌注的加重导致压力差出现，脑侧支循环代偿开放较多［19］。根据训练集中logistic回归分析结果构建ACI病人侧支循环形成不良预测模型，该模型AUC 为0.88［95%CI：（0.84，0.92）］，对ACI病人侧支循环形成不良具有较好的预测价值。

综上所述，侧支循环良好病人外周血血清miR-181b 表达水平较高，脑血管狭窄程度轻和高水平miR-181b 为侧支循环形成不良的保护因素，而高血压史、Hcy、后循环病变均为脑梗死病人侧支循环形成不良的独立危险因素，当然本研究也存在一定的不足之处，本研究属于单中心研究，纳入研究对象可能不足，导致部分结果存在偏倚，因此下一步我们将开展多中心大样本研究，从而对本研究成果进一步地验证。