血管性认知功能障碍病人血清微RNA-335-5p、血清应答因子水平及其临床意义

姚洁，王尚臣，褚丽芳，朱倩

作者单位：石家庄市人民医院神经内一科，河北 石家庄 050000

脑卒中是一种具有高复发率、高致残率的急性脑血管疾病，包括缺血性脑卒中和出血性脑卒中，我国每年约200 万新发病例［1］。血管性认知功能障碍（vascular cognitive impair-ment，VCI）是由于脑血管损伤导致的认知能力降低和生活能力减退的综合征，是老年人常见的认知障碍，其包括从轻度认知障碍到血管性痴呆（vascular dementia，VD）［2］。据报道，30%的脑卒中病人将出现不同程度的VCI，影响脑卒中后病人康复，并给家庭、社会造成负担［3］。VCI 具有可防治性，发病早期有效诊疗能够在一定程度上逆转病情，减少痴呆发生。因此，需要更好地了解VCI 疾病进展的病理生理学，以制定新的干预措施。

微RNA（microRNA，miR）属于小型无编码能力的RNA，以往研究证实miRNA 在VCI 病人血清、脑脊液等体液循环中差异表达，容易检测，是一种新型VCI诊断指标［4］。miR-335-5p是miRNA 家族成员之一，有研究指出，miR-335-5p 在VD 中具有重要作用，可以作为VD 诊断、治疗标志物［5］。亦有研究指出，50%肌萎缩侧索硬化症病人表现出行为和认知功能障碍，且血清中检测到miR-335-5p水平降低［6］。血清应答因子（vascular cognitive impair-ment，SRF）位于染色体6p21.1 上，是一种普遍表达的MADSbox转录因子，参与氧化应激。SRF在阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）中的高表达能够推动疾病进展［7］。本研究通过检测脑卒中后VCI 病人血清miR-335-5p、SRF 水平，并进一步明确miR-335-5p、SRF 异常表达与认知功能的相关性，以期为VCI 的早期诊断与治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料以石家庄市人民医院2019 年1 月至2020 年12 月因脑卒中治疗后6 个月合并VCI 病人110 例为研究对象（VCI 组），且蒙特利尔认知评估量表（Montreal cognitive assessment，MoCA）评分＜26 分，其中男67 例、女43 例，年龄（61.46±8.15）岁。纳入标准：①脑卒中诊断符合《中国急性脑卒中临床研究规范共识2018》［8］诊断标准，并结合临床检查确诊；②VCI符合《2016中国血管性认知障碍诊疗指导规范》诊断标准，且治疗后6 个月的脑卒中病人MoCA 评分＜26 分［9］。③年龄≥18 岁，首次确诊为脑卒中；④签署知情同意书。排除标准：①发病前存在认知障碍、继发性脑卒中病人；②合并肢体功能障碍、合并心肺肝肾疾病；③合并失语、构音障碍、视觉障碍或听觉障碍，无法完成检查；④凝血功能障碍；⑤脑肿瘤或其他颅脑疾病；⑥早期出现进行性恶化的记忆缺陷。本研究经石家庄市人民医院伦理委员会批准同意（批号2018-11-0178）。将110例病人进一步根据《美国精神障碍诊断与统计手册》第5 版［10］分为非痴呆型血管性认知功能障碍（vascular cognitive impairment with no dementia，VCIND）组，血管性痴呆（VD）组。同时间段该院110例脑卒中无VCI 的病人作为对照组，男69 例，女41例，年龄（59.08±8.36）岁。脑卒中病人发病后6个月时采用MoCA 评估受试者认知功能，并将MoCA 评分＜26 分的病人作为VCI 组。同时对脑卒中病人于发病时（入院次日）、发病后1 年分别采用MoCA 评估受试者认知功能，比较VCIND 组、VD 组以及对照组病人MoCA评分差异。

1.2 方法

1.2.1 资料收集入院时统计病人以下资料：（1）一般资料：年龄、性别、基础疾病史、饮酒史（乙醇量≥36 g/d，持续半年）、脑卒中类型（出血性/缺血性）、脑卒中部位（皮层/基底核/丘脑/小脑/脑干/其他）、吸烟史（≥1 支/天，持续半年）、美国国立卫生研究院卒中量表（National Institute of Health Stroke Scale，NIHSS）评分等；（2）入院时生化指标检查结果：三酰甘油、C 反应蛋白（C-reactive protein，CRP）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、空腹血糖、总胆固醇、血同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）。

1.2.2 实时荧光定量PCR 检测血清miR-335-5p、SRF 水平所有研究对象分别于发病时（入院次日）、发病后6 个月、发病后1 年时清晨抽取空腹肘静脉血，离心半径8 cm，3 000 r/min 离心10 min，取上层血清，并置于-80 ℃超低温冰箱中贮存，备用。采用miRNA 抽提试剂盒（货号DP503）得到miRNA，按照miRcute 增强型miRNA 互补DNA（cDNA）第一链合成试剂盒（货号KR211-01）说明书将RNA 反转录为cDNA 后稀释至等量浓度，使用荧光定量检测试剂盒（货号FP411）中反应混合液配制反应体系，并在Mx3005P QPCR（Aglient，美国）扩增仪上采集信号。

取血清样品，采用Trizol试剂（货号DP424）得到总RNA，然后利用反转录试剂盒（货号KR106）得到cDNA，利用FastFire qPCR PreMix 试剂盒（货号FP207）配制混合体系，同样在Mx3005P QPCR 仪器上进行PCR 反应。miR-335-5p以U6为内参，SRF 以β 肌动蛋白（β-actin）为内参，采用2-ΔΔCt法计算相对表达量。试剂盒均由天根生化科技有限公司提供。引物序列见表1。

表1 实时荧光定量PCR检测血清miR-335-5p、SRF水平引物序列

1.3 统计学方法应用SPSS 23.0 处理数据。符合正态分布的计量资料如CRP、SRF、NIHSS 评分以表示，两组间比较采用两独立样本t检验，三组间行单因素方差分析，组内两两比较为LSD 法；不同时间点血清miR-335-5p、SRF 水平及MoCA 评分比较采用双因素重复测量方差分析。计数资料以例（%）表示，采用χ2检验。logistic 回归模型分析脑卒中病人发生VCI 的影响因素。Peasrson 法分析血清miR-335-5p 与SRF 水平的相关性。受试者操作特征曲线（ROC 曲线）分析血清miR-335-5p、SRF 预测脑卒中后VCI 的效能，曲线下面积（AUC）比较采用Z检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组受试者基线资料比较对照组与VCI 组受试者年龄、饮酒史、NIHSS 评分、Hcy 水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；两组受试者性别、吸烟史、脑卒中类型、脑卒中部位、受教育年限、高血压、糖尿病、冠心病、高脂血症、三酰甘油、总胆固醇、LDL-C、CRP、HDL-C 及空腹血糖水平相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 两组受试者基线资料及临床指标分析

2.2 两组受试者血清miR-335-5p、SRF 水平比较对照组与VCI 组受试者发病时血清miR-335-5p、SRF 水平比较显示，VCI 组血清miR-335-5p 表达水平低于对照组（0.76±0.15 比1.06±0.07），SRF 水平高于对照组（1.52±0.24比1.01±0.09），差异有统计学意义（t=19.01、20.87，均P＜0.001）。

2.3 三组受试者不同时间点血清miR-335-5p、SRF水平及MoCA 评分比较对照组受试者发病时、发病后6个月及1年时MoCA评分、miR-335-5p、SRF水平相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。VD 组、VCIND 组受试者在发病后6 个月、发病后1 年时MoCA 评分、SRF 水平低于发病时，而miR-335-5p 水平高于发病时，差异有统计学意义（P＜0.05）；VD 组受试者发病后1年MoCA 评分低于发病后6个月，差异有统计学意义（P＜0.05）；VCIND 组发病后1 年受试者MoCA 评分、miR-335-5p 水平、SRF 水平与发病后6 个月相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。发病时，三组受试者的MoCA评分差异无统计学意义（P＞0.05），而对照组、VCIND 组、VD 组的miR-335-5p 水平逐次降低，SRF水平呈升高趋势，差异有统计学意义（P＜0.05）。发病后6 个月及发病后1 年时，对照组、VCIND 组、VD 组MoCA 评分均逐次降低，差异有统计学意义（P＜0.05），而miR-335-5p水平、SRF水平无明显变化（P＞0.05）。三组MoCA评分、miR-335-5p、SRF 组间、时间、交互作用差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 三组受试者不同时间点MoCA评分、血清miR-335-5p及SRF水平比较/

表3 三组受试者不同时间点MoCA评分、血清miR-335-5p及SRF水平比较/

注：MoCA 评分为蒙特利尔认知评估量表评分，SRF 为血清应答因子。①与本组发病时相比，P＜0.05。②与对照组同时间相比，P＜0.05。③与本组发病后6个月相比，P＜0.05。④与VD组同时间相比，P＜0.05。

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2.4 相关性分析发病时，VCI 组血清miR-335-5p与SRF水平存在负相关性（r=-0.64，P＜0.001）。

2.5 脑卒中病人发生VCI 的影响因素分析以VCI 为因变量，将单因素分析中差异有统计学意义的年龄、NIHSS 评分、饮酒史、Hcy、miR-335-5p、SRF为自变量，进行logistic 回归分析。年龄、NIHSS 评分、miR-335-5p、SRF 是影响脑卒中病人发生VCI 的危险因素（P＜0.05）。见表4。

表4 脑卒中病人220例发生VCI的影响因素分析

2.6 血清miR-335-5p、SRF 预测VCI 的ROC 曲线ROC 分析显示，血清miR-335-5p 水平预测脑卒中后VCI 的AUC 为0.88［95%CI：（0.84，0.93）］，截断值为0.92，灵敏度为78.20%，特异度为87.30%；血清SRF 水平预测脑卒中后VCI 的AUC 为0.90［95%CI：（0.86，0.95）］，截断值为1.20，特异度为93.60%，灵敏度为79.10；miR-335-5p 联合SRF 预测VCI 的AUC为0.93［95%CI：（0.89，0.97）］，特异度为89.20%，灵敏度为79.10%。3 种预测方式的AUC 比较显示：miR-335-5p 与SRF 的Z=0.66、P=0.511，miR-335-5p与联合的Z=2.28、P=0.023，SRF与联合的Z=2.12、P=0.034。

3 讨论

VCI 是由多种脑血管疾病引起的异质性疾病，表现为认知处理速度较慢、执行功能较差，致残率高［2］。脑卒中是临床常见且具有高致残率的脑血管疾病，约30%的病人在发病后出现VCI［11］。目前，VCI的临床诊断包括临床评估、神经影像学检查、神经认知功能测试，但均存在诊断局限性［12］。其中，VCI 病人出现明显症状时已处于晚期，错过最佳治疗时间；神经影像学检查难以区分VD 及AD；神经认知功能测试尚无广泛认可的认知功能测试。因而，需要探究能够用于临床早期诊断VCI 的血清学指标，以便于及时采取治疗措施，有效逆转病情，避免痴呆等不良后果。本研究结果显示，对照组与VCI组受试者年龄、饮酒史、NIHSS评分、Hcy水平比较，差异有统计学意义；并经logistic 回归分析发现，年龄、NIHSS 评分是影响脑卒中病人VCI 的危险因素。黄晓芸等［13］同样发现，年龄、NIHSS评分是影响脑卒中后VCI的危险因素，说明对于高龄、NIHSS 评分较高者，临床上应给予重视。

VCI 涉及多种病理生物学变化，脑灌注不足和神经血管单元损伤是VCI 的主要病理生物学机制，而炎症因子的大量释放通过作用于局部神经元，通过破坏神经元结构，影响认知功能［14］。以往研究显示，miRNA 在调节炎症反应、神经元发育、造血、受损组织的修复和重塑、氧化应激等中发挥关键作用［4］。近期，有学者发现，miR-335-5p 可能是脑卒中［15］、VD［5］的关键预后标志物和新的治疗靶点。此外，miR-335-5p 还在肌萎缩侧索硬化症病人血清中下调表达，miR-335-5p 的下调会增强SH-SY5Y 的线粒体自噬和凋亡，增加活性氧和超氧化物歧化酶活性［6］。本研究首次利用荧光定量PCR 技术检测了miR-335-5p 在脑卒中后VCI 病人血清中水平变化，结果发现，VD 组发病时血清miR-335-5p 表达水平明显低于VCIND 组、对照组，VCIND 组又低于对照组，说明血清miR-335-5p 表达水平越低，脑卒中后认知功能障碍越严重。发病后6 个月及1 年时VCIND 组、VD 组血清miR-335-5p 水平即恢复至对照组水平，说明miR-335-5p 可能仅在脑卒中后前期参与认知功能障碍形成过程。过表达miR-335-5p能够抑制炎症因子分泌，降低G 蛋白偶联受体激酶4 表达水平，保护HA-VSMC 减少损伤［16］。基于本研究结果，推测脑卒中病人发病时血清miR-335-5p 越低，病人越易发生认知功能障碍，而miR-335-5p 的低表达导致机体炎症因子大量分泌，损伤血管内皮，斑块形成，阻碍血运重建，加速脑血管损伤，增加VCI 风险。本研究多因素logistic 回归分析发现，miR-335-5p 水平降低是VCI 发生的独立危险因素，说明miR-335-5p 水平与脑卒中后认知障碍发生显著相关，miR-335-5p 水平减少，VCI 发生风险增加。因而，本研究利用ROC 曲线分析了miR-335-5p 对VCI 的预测价值，发现AUC 为0.88［95%CI：（0.84，0.93）］，提示脑卒中病人发病时检测血清miR-335-5p水平能够及早预测VCI发生，并尽早治疗。

SRF 是一种高度通用性转录因子，参与调节神经元的迁移、神经突出、轴突和树突分化以及突触功能［17］。SRF的缺失导致小鼠模型体内肝星状细胞的活性氧水平，改善肝纤维化，说明SRF 参与氧化应激过程［18］。SRF还在AD小脑动脉中的过表达，能激活SRF 依赖的SM 收缩基因而增加动脉收缩力减少血流量，被证实有助于疾病进展［7］。本研究结果显示，在VCI 组受试者血清中SRF 水平明显高于对照组，说明SRF 与认知功能障碍形成有关。进一步分析发现，发病时，对照组、VCIND 组、VD 组SRF 水平逐次升高，说明脑卒中后SRF 水平越高，病人后期认知障碍越严重；发病后6 个月、发病后1 年时VCIND 组、VD 组血清SRF 恢复至与对照组相同水平，说明SRF 可能仅参与脑卒中发病后VCI 形成过程，当VCI 形成后，病人SRF 水平即恢复至正常水平。SRF 水平升高是影响VCI 发生的危险因素，说明SRF 水平与认知障碍程度有关，早期监测血清SRF 水平变化，能够辅助临床VCI的诊断。此外，有学者认为SRF 可替代Scr 作为AKI 潜在的新早期诊断标志物［19］。本研究ROC 显示，血清SRF 水平预测脑卒中后VCI 的AUC 为0.90［95%CI：（0.86，0.95）］，提示SRF 预测VCI 的效能较高。Pearson 相关性发现，miR-335-5p与SRF存在负相关，说明二者可能在脑卒中后VCI 过程中存在相互作用，但具体调控机制仍待后续探究。为了提高miR-335-5p、SRF 对VCI 预测效能，本研究将miR-335-5p 联合SRF 预测VCI，结果显示AUC 为0.93，明显高于miR-335-5p、SRF 单独预测效能，这说明将miR-335-5p 联合SRF能显著提高诊断效能。

综上所述，miR-335-5p、SRF 与脑卒中后VCI 形成密切相关，miR-335-5p 水平降低，SRF 水平上升，将导致VCI 病情加重，且二者联合能够用于临床预测VCI 发生。本研究纳入样本量较少，血清miR-335-5p、SRF 对脑卒中后VCI 发生的预测效能还需要后续扩大样本量论证，同时需要开展细胞实验等探究miR-335-5p、SRF在VCI中的具体调控机制。