基于超高效液相色谱-质谱联用技术的慢性肾脏病骨代谢异常大鼠血清代谢组学研究

李瑾，李雨静，邢晖林，邓喜文，郭明好

作者单位：新乡医学院第一附属医院肾脏内科，河南 新乡 453000

慢性肾脏病（chronic kidney diseases，CKD）全球发病率已超过10%，呈现发病率高、并发症多的特点［1］。慢性肾脏病骨代谢异常（chronic kidney diseases bone disorder，CKD-BD）特指与CKD 相关的骨组织学异常，临床表现为骨痛、骨骼变形及骨折发生率增加，是CKD 矿物质及骨代谢异常（chronic kidney disease-mineral bone disorder，CKD-MBD）的重要组成部分，是CKD 的严重并发症，也是病人致残、致死等不良结局的重要原因之一［2］。目前CKDBD发病机制尚不明确，临床治疗效果欠佳。尿毒症毒素是指随着CKD 进展、肾小球滤过率下降，不断蓄积在病人体内的异常代谢产物，可导致代谢紊乱或产生一系列临床表现［3］。目前已有研究证实尿毒症毒素参与了CKD 病人多种并发症发生，例如尿毒症心肌病、尿毒症脑病等［4-5］，然而尿毒症毒素在CKD-BD 中的作用尚不明确。本研究于2021 年1 月至2022 年4 月通过构建CKD-BD 大鼠模型，借助超高效液相色谱-质谱（UHPLC-MS）联用技术，了解CKD-BD 大鼠血清代谢组学变化，探索尿毒症毒素在CKD-BD 发病中的作用，为CKD-BD 的临床干预提供依据。本研究符合一般动物实验伦理学原则。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂四环素（美国Sigma 公司，批号87128）、钙黄绿素（美国Merck 公司，批号0875）、水合氯醛（中国国药公司，批号H37022673）、Goldner's三色染色试剂盒（广州三旭生物科技公司）、包埋树脂液（德国Technovit公司）。纯化鼠粮购自广州佰汇生物科技有限公司，大鼠全段甲状旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）试剂盒购自美国SAB公司。

1.1.2 主要仪器硬组织切片机（德国EXAKT 公司，型号310CP）、磨片机（德国EXAKT 公司，型号400CS）、光固化机（德国EXAKT 公司，型号E520）、荧光显微镜（日本奥林巴斯公司，型号BX53）、超高效液相质谱仪（Thermo Fisher Scientific，型号Vanquish）、骨形态学图像分析系统（美国 Bioquant，型号BIOQUANT OSTEO）。

1.1.3 实验动物16 只8 周龄SPF 级SD 雄性大鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，体质量范围为240～260 g，分笼饲养于24～28 ℃的环境中，每日更换垫料，自由摄食及饮水。

1.2 方法

1.2.1 骨代谢异常大鼠动物模型建立通过高磷高腺嘌呤饮食诱导CKD-BD 大鼠，具体方法如下：所有大鼠经过1 周适应性喂养后，随机数字表法分为两组，每组8 只：（1）健康对照组（NC 组）：使用普通大鼠饲料喂养90 d；（2）CKD-BD 组：采用高磷高腺嘌呤饲料（含1.8 % 磷及0.75 % 腺嘌呤）喂养60 d之后更换高磷饲料（含1.8%磷）喂养30 d 后处死。大鼠处死前15 d 及14 d 腹腔注射四环素（30 mg/kg），处死前3 d 及2 d 腹腔注射钙黄绿素（5 mg/kg），四环素及钙黄绿素注射液均为当日配制且避光保存。水合氯醛腹腔麻醉大鼠后，腹主动脉采血处死大鼠。离心后取血清置于-80 ℃冰箱分装保存。分离大鼠右侧股骨，中性福尔马林固定。

1.2.2 血清生化指标检测使用BeckmanAU 5800全自动生化分析仪检测血钙、磷、肌酐。采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测血清全段PTH水平。

1.2.3 皮质骨包埋及切片制备大鼠右侧股骨标本经福尔马林液固定48 h 后，行梯度酒精（70%，80%，95%）脱水，每步24 h。脱水后浸泡于Technovit 7200 树脂液中，使用光固化机包埋聚合。固化后的组织块用硬组织切片机切取厚度约200 μm的切片，并使用磨片机打磨至20 μm，最后以4 000目砂纸抛光。磨片根据试剂盒说明进行Goldner's 三色染色：首先将磨片放入Weigert's 苏木素液染色15 min，再用流动水漂洗10 min，后使用酸性品红－丽春红染液染色5 min。使用1%冰醋酸洗2 次后用1%磷钼酸染色，直到胶原脱色，再用1%冰醋酸洗2 次，2%亮绿液染色5 min，1%冰醋酸洗2 次，滤纸吸干，封片在显微镜下进行骨形态计量学检测。

1.2.4 骨形态计量学检测染色后的切片进行骨形态计量学检测，按照国际通用的Frost标准骨组织形态计量学检测方法对骨转运的动态参数进行测量，以骨矿化沉积率（mineral apposition rate，MAR）反映新骨矿化速度，以骨形成率/骨体积（bone formation rate/bone volume，BFR/BV）反映骨转换率。

1.2.5 大鼠血清代谢组学检测通过UHPLC-MS联用技术检测两组大鼠血清代谢产物。色谱条件：使用Vanquish （Thermo Fisher Scientific）超高效液相色谱仪，通过Waters ACQUITY UPLC BEH Amide（2.1 mm×100 mm）液相色谱柱对目标化合物进行色谱分离。液相色谱A相为水相，含25 mmol/L乙酸铵和25 mmol/L 氨水，B 相为乙腈。样品盘温度：4 ℃，进样体积：2 μL。质谱条件：采用Orbitrap Exploris 120 质谱仪进行一级、二级质谱数据采集。相关参数设定如下：毛细管电压正、负离子条件下分别设定为3.8 kV 和-3.4 kV。鞘气流速：50 Arb。辅助气流速：50 Arb。毛细管温度：320 ℃。分辨率为6 000进行全扫描。

1.3 统计学方法生化指标及骨形态计量学参数使用SPSS 25.0统计软件进行数据分析，计量资料使用表示，组间比较采用两独立样本t检验，P＜0.05视为差异有统计学意义。质谱数据使用SIMCA软件进行统计分析：如主成分分析 （principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal projections to latent structures- discriminant analysis，OPLS-DA）。利用京都基因和基因组数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）数据库对差异代谢产物进行代谢通路分析。

2 结果

2.1 各组大鼠血清生化指标变化与NC 组大鼠相比，CKD-BD 组大鼠表现出肌酐升高、低血钙、高血磷、高PTH的特点（P＜0.01）。见表1。

表1 造模后两组大鼠血清生化指标比较/

表1 造模后两组大鼠血清生化指标比较/

注：NC 为健康对照，CKD-BD 为慢性肾脏病骨代谢异常，PTH 为甲状旁腺激素。

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2.2 各组大鼠骨组织形态变化通过四环素-钙黄绿素活体荧光双标记对各组大鼠的骨组织形态进行观察，见图1。黄色荧光为大鼠处死前第15 天和第14天注射四环素标记的矿化带，绿色荧光为大鼠处死前第3 天和第2 天注射钙黄绿素标记的矿化带，黄色和绿色标记间的区域，即该段时间的新生骨矿化区域（白色箭头处为明显的新骨矿化区域）。NC 组大鼠可见正常的成骨矿化带，CKD-BD 组可见骨矿化带增宽、矿化区域增多。骨形态计量学检测发现NC 组大鼠MAR 为（1.90±0.61）μm/d，CKD-BD组大鼠MAR 为（2.80±0.73）μm/d，差异有统计学意义（t=2.97，P=0.010）。NC 组大鼠BFR/BV 为（0.41±0.20）%/d，CKD-BD组大鼠BFR/BV为（1.25±0.41）%/d，差异有统计学意义（t=5.20，P＜0.001）。提示CKD-BD组大鼠骨转换水平高于NC 组，呈现高骨转换率、高新骨矿化速度的特点，与CKD-BD形态特征相符。

图1 两组大鼠骨组织形态变化（四环素-钙黄绿素荧光染色×200）：A为正常对照（NC）组大鼠，可见正常的成骨矿化带；B为慢性肾脏病骨代谢异常（CKD-BD）组，可见骨矿化带增宽，矿化区域增多

2.3 各组大鼠血清代谢谱PCA比较两组大鼠血清样本在正负离子下的总离子流，发现在负离子模式下，可获得较强的化合物响应和更为丰富的化合物信息，故后续采用负离子模式进行检测。PCA 图中的每一个符号点代表1 个血清样品，各组样品在空间分布位置不同，代表了不同组别样本的代谢状况不同。NC 组与CKD-BD 组的组间分离趋势明显，同组的样本呈现聚集趋势，提示样本代谢产物在组间有明显差异，同时组内的稳定性良好，见图2。

2.4 OPLS-DA为进一步比较组间差异变量，通过OPLS-DA分析方法对大鼠血清样品进行差异分析。图中NC 组与CKD-BD 组分离显著，提示CKD-BD 状态下大鼠血清代谢产物发生变化，见图3。

2.5 两组大鼠血清差异代谢物功能分析以P＜0.05，变量投影重要度大于1 为过滤标准对各组间差异代谢物进行筛选，在NC组与CKD-BD组大鼠间筛选到37 种差异代谢物。将差异产物的定量值进行比较，以log2（fold change）表示差异的倍数关系，变化上调倍数前5名的物质为：姜醇、丙酮酸、甲酚、硫酸甲酚、苯乙酰，变化下调倍数前5 名的物质为：硬脂酸、辛葵烯酸、胆汁酸、α-亚麻酸、羟基吲哚乙酸。借助KEGG数据库对以上差异代谢产物进行功能分析和通路富集。根据差异代谢物在KEGG代谢通路中的富集结果，计算Rich Factor（某一通路中注释到的差异代谢物数量与该通路中所有代谢物数量的比值），该值越大表示富集程度越大。结果表明，两组间差异代谢产物涉及甘油磷脂代谢、神经传导、自噬、糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白合成、胆汁分泌等生理过程。差异丰度得分可以反映出某一通路中所有差异代谢物的总体变化趋势。结果表明，与NC 组相比，CKD-BD 组糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白合成等通路上调。自噬、胆汁酸合成分泌、胆固醇代谢、牛磺酸和次级牛磺酸代谢、甘油磷脂代谢等通路下调（P＜0.05）。这其中，参与自噬通路的两组间差异代谢产物为磷脂酰乙醇胺。

3 讨论

CKD 病人随着肾小球滤过率逐渐下降，尿毒症毒素在体内蓄积，由此产生一系列临床症状及并发症［6］。研究发现尿毒症毒素与CKD 病人食欲下降、恶心呕吐等消化道症状相关［5］。另有研究证实，尿毒症毒素参与了CKD病人血管并发症的发生［7］。此外还有研究发现尿毒症毒素影响了CKD 病人全身炎症状态［8］。CKD-BD 是CKD 常见的并发症之一，目前发病机制尚不明确。CKD-BD 早期临床表现较为不典型，随着疾病进展逐渐出现骨痛、骨骼变形等晚期症状［9-10］。已有研究发现，肠道来源的尿毒症毒素硫酸吲哚酚可通过抑制成骨细胞活性、诱导骨骼对PTH的抵抗等机制参与CKD-BD发生［11］。我们的研究中，发现CKD-BD 大鼠与NC 大鼠相比，血清代谢产物谱发生明显变化。经过功能分析，发现异常的代谢产物涉及甘油磷脂代谢、神经传导、自噬、糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白合成等生理过程。

糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白是真核生物细胞膜表面蛋白质与细胞膜锚定的重要结构，参与了细胞与外界信号传导等过程［12-14］。本研究发现，CKD-BD 组糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白合成通路上调，提示在慢性肾衰竭的环境下，细胞与外界信息传递更为复杂。

此外，本研究发现与NC 组大鼠相比，CKD-BD组大鼠血清中与自噬相关的代谢产物发生变化。自噬是真核细胞在基因调控下利用溶酶体降解自身细胞质蛋白和受损细胞器的过程，可防止细胞损伤，促进细胞在营养缺乏的情况下存活，并对细胞毒性刺激作出反应［15-17］。研究证实在低氧、炎症等病理条件下，影响骨代谢水平的重要细胞骨髓间充质干细胞可通过增强自噬作用改善骨代谢状态［18］。本研究发现CKD-BD 组与自噬相关的代谢产物磷脂酰乙醇胺表达低于NC 组，研究证实磷脂酰乙醇胺低表达可影响自噬溶酶体的形成，引起自噬相关通路下调［19］，这提示自噬水平下降是CKD 环境下骨代谢异常的机制之一。此外既往研究发现，牛磺酸可通过ERK1/2 信号途径刺激成骨细胞的增殖和分化，且牛磺酸可通过激活自噬减少骨量丢失，起到骨保护作用［20-21］。本研究中，牛磺酸代谢途径在CKD-BD 组下调，提示CKD 病人牛磺酸代谢异常可能参与了CKD-BD 的发展，进一步研究可关注外源性补充食物或药物等物质对CKD骨骼的保护作用。

综上所述，通过UHPLC-MS 技术比较CKD-BD大鼠与正常大鼠血清代谢产物，发现两者发生明显变化。CKD-BD 组大鼠血清中与细胞间信号传递的信号通路上调，提示CKD 状态下细胞信息传递更为复杂。同时与自噬相关的代谢通路下调，可能是影响机体骨代谢水平、导致CKD-BD发生的机制之一。

（本文图1见插图3-5）