大肠杆菌快速检测系统设计与实现

吴学斌，庞春颖，魏佳淇，郭云轩，顾峰

（1.长春理工大学 生命科学技术学院，长春 130022；2.中国农业科学院长春兽医研究所，长春 130122；3.陕西省人民医院，西安 710003）

近年来，由食源性病原体引起的疾病已成为主要公共卫生问题之一。食源性病原体种类繁多，其中大肠杆菌O157：H7 是最为常见、严重的一种［1］。大肠杆菌O157：H7 是条件性致病菌，在一定条件下会导致腹泻、出血性结肠炎和溶血尿毒症综合征等疾病，甚至会危及幼儿和体弱者生命，因此对食品和水源中的大肠杆菌O157：H7进行快速、广泛的检测具有重要的现实意义。

目前，对于大肠杆菌的检测主要采用培养基培养、酶联免疫吸附实验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）和聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）等。培养基培养的方法具有较好的特异性，但是整个过程复杂耗时，需持续约4 天，操作费时费力；PCR 作为扩增核酸的常用技术，具有较高的准确性，但是由于DNA 提取、扩增等样品制备步骤复杂，操作过程易形成气溶胶污染，成本较高，需要昂贵的热循环仪和训练有素的专业人员，不适合现场及户外检测；ELISA 法大多用来进行血清学诊断检测生物样品中是否存在抗原或抗体，尽管ELISA 测试灵敏度较高，但仍不适合现场检测，因为ELISA 需要大型精密仪器进行光学检测和一定的孵育时间［2-5］。以上方法均在实际样品应用检测时缺乏即时诊断所需的重要特征，即反应快速和操作简便。近年来随着技术的不断发展，建立了多种基于新型生物传感器系统的检测方法。其中，电化学生物传感器由于其具备反应迅速、检测限低、信号读取方便等优势，在临床诊断及食品安全领域受到了研究人员的青睐，具有广阔的应用前景［6］。横向流动免疫分析法（Lateral Flow Immunochromatographic Assay，LFIA）是一种在20 世纪发展起来的体外检测工具诊断技术，是即时检测（Point of Care Testing，POCT）的主要技术之一［7］，它具有操作时间短、操作简单、经济效益大、适用于现场检测的特点。例如核酸测试被认为是诊断冠状病毒引起的肺炎（COVID-19）的“黄金标准”。

针对以上分析，本系统基于电化学横向流动免疫分析技术配合STM32 单片机设计了一种便携式大肠杆菌快速检测系统，完成了电化学横向流动免疫分析平台的设计，改善了试纸条只能定性检测的问题，建立了大肠杆菌浓度O157：H7 与电流强度的线性关系，实现了大肠杆菌O157：H7 的快速定量检测［8-10］。

1 检测原理

本设计利用电化学横向流动免疫分析技术和嵌入式技术设计一款大肠杆菌快速检测系统。电化学免疫分析平台可将滴加的大肠杆菌O157：H7 溶液浓度信息转化为电流信号，该信号由丝网印刷电极传输到嵌入式系统，嵌入式系统再对电流信号进行检测、放大、处理和分析，最终计算出大肠杆菌O157：H7 溶液的浓度。

系统检测原理框图如图1 所示。检测时将待检测液体滴加至电化学横向流动免疫分析平台的样品垫上，检测液中的大肠杆菌O157：H7可与结合垫上的Fc-MI 偶联物结合（如步骤①），随后与Fc-MI 偶联物结合的大肠杆菌O157：H7在测试垫与其特异性抗体结合（如步骤②），最后Fc-MI 偶联物中含有的二茂铁表现出电特性，产生的电流经丝网印刷电极输出到嵌入式检测系统（如步骤③）。

图1 系统检测原理框图

2 系统总体设计

系统的设计基于电化学横向流动免疫分析技术。系统总体设计框图如图2 所示，分为电化学横向流动免疫分析平台和嵌入式检测系统两部分。电化学横向流动免疫分析平台负责接收滴加的大肠杆菌O157：H7 溶液，并将大肠杆菌溶液浓度信息转化为电流信号。嵌入式检测系统包括STM32 主控芯片及其外围的各个电路，负责采集、放大、处理丝网印刷电极传入的电流信号，并根据拟合函数计算大肠杆菌O157：H7 浓度，从而实现对大肠杆菌O157：H7 的检测。

图2 系统总体设计框图

3 横向流动免疫分析平台

3.1 横向流动免疫分析平台结构组成

电化学横向流动免疫分析平台负责将大肠杆菌O157：H7 溶液的浓度信息转化为电信号。

平台结构如图3 所示。平台由五部分组成，包括样品垫、结合垫、测试条、吸收垫和丝网印刷电极。样品垫接收含有大肠杆菌O157：H7 的溶液，并作为过滤器帮助液体流动。结合垫上的Fc-MI 偶联物可与大肠杆菌O157：H7 结合形成靶标Fc-MI 复合物。测试条上的特异性抗体可识别并捕获与Fc-MI 结合的大肠杆菌O157：H7。丝网印刷电极提供电流回路，为平台提供电压的同时输出电化学反应产生的电流。

图3 电化学横向流动免疫分析平台结构图

3.2 横向流动免疫分析平台制备

电化学横向流动免疫分析平台的制备包括丝网印刷电极的设计、横向流动装置的制作以及ELFIA 测试条的功能化三步。

本研究采用三电极系统，包括工作电极（WE）、对电极（CE）和参比电极（RE）［11-12］。工作电极和对电极由石墨烯糊制成，参比电极由Ag/AgCl 油墨制成。

横向流动测试条由五个部分组成，包括样品垫、结合垫、硝化纤维素膜、吸收垫和丝网印刷电极。每个组件都安装在背板上，组件之间有2 mm的重叠，而丝网印刷电极连接在背板和硝化纤维素膜之间。另外，还需制备结合垫所需的二茂铁抗菌肽偶联物（Fc-MI）。首先，将二茂铁羧酸（10 mg）完全溶解在1 mL 的HEPES 缓冲液（50 mM，pH 7.4）中。然后在溶液中分别加入了10 mg NHS 和15 mg EDC。然后，通过在室温下连续搅拌2 h，激活该混合物中二茂铁羧酸上的羧基。然后，将200 μL 浓度为1 mg/mL 的抗菌肽MI（使用超纯水溶解干粉）滴加入混合物中，在室温下连续搅拌12 h。孵育后，将偶联物在3 000 rpm 下离心10 min，以去除任何沉淀。然后，将上清液以11 000 rpm 离心30 min。将以这种方法制备的Fc-MI 偶联物颗粒用超纯水稀释至1 mL，并在4 ℃下保存。

首先将1 μL 大肠杆菌O157：H7 抗体（1 mg/ml）应用于硝化纤维素膜检测区，在37 ℃下烘烤30 min。然后将制备的5 mL 的Fc-MI 放在结合垫上，最后在37 ℃下烘烤30 min。

完成上述三个步骤后，电化学横向集成免疫分析平台即可连接嵌入式检测系统进行实验，实物图如图4 所示。

图4 电化学横向流动免疫分析平台实物

4 嵌入式检测系统

4.1 硬件设计

硬件电路主要由I/V 转换电路、放大电路、滤波电路、A/D 转换电路和电源模块等构成。I/V转换电路负责将电化学集成免疫分析平台输出的电流信号转化为电压信号。放大电路将信号进一步放大，以便信号检测。滤波电路滤除噪声，保证结果稳定性。A/D 转换电路则是将处理好的模拟信号转换为单片机可识别的数字信号［13］。

主控单元采用ST 公司的STM32F407ZGT6 作为主控芯片，通过控制单片机的SPI 接口、ADC接口、IIC 接口与相应的参数采集模块进行数据传输，并且该单片机具有浮点运算器并支持DSP功能，能够实现对数字信号的处理与分析。主控单元资源分配如下：采用GPIOA9、GPIOA10 引脚的USART1 功能，通过CH340G 芯片构成USB转串口一键下载电路，实现程序的调试与下载；触摸屏通信采用跳线帽转换，实现与USB 转换电路共用USART1，进行指令发送与接收；采用GPIOF7 引脚的ADC3 功能，对输入的模拟信号进行12 位模数转换。

I/V 转换电路采用AD825 运算放大器，该芯片具有噪声低、稳定性高、抑制电源高频噪声、不易受温度影响等优点，其电路设计如图5 所示。

图5 I/V 转换电路原理图

I/V 转换电路采用负反馈放大设计，电流信号由反相输入端输入，输出端经电阻与反向输入端相连，放大倍数由输出端与输入端之间的等效电阻决定。同时，电路中采用T 型反馈网络结构，可实现信号的大倍数放大，同时可避免大阻值电阻引入的噪声干扰。Uout1的计算公式如下：

计算结果如下：

放大电路采用LF353 运算放大器，采用二级放大设计，将信号放大相应倍数，同时避免电路陷入自激状态。LF353 芯片采用场效应管作为差分输入级，具有很高的输入阻抗及较低的输入噪声电压，输出级为NPN 和PNP 构成的互补射极跟随器，具有较强的带负载能力。放大电路原理如图6 所示。

图6 放大电路原理图

图中一级放大电路采用反向比例放大电路，Uin作为信号输入，U1为一级放大后的信号，反馈电阻采用滑动变阻器，可根据放大倍数的需要对反馈阻值进行调整，U1的计算公式如下：

二级放大电路采用差动放大设计，R6=R9，R7=R10，Uout2的计算公式如下：

信号滤波电路的设计主要针对可充电锂电池的干扰，可充电锂电池产生的干扰信号频率在100 MHz 左右。为降低噪声对系统信号的干扰，本系统采用OP27 运放芯片，设计低通滤波电路，针对干扰信号的频率范围，设置带通截止频率为2 Hz，滤波电路原理如图7 所示。

图7 滤波电路原理图

滤波电路截止频率计算公式如下：

滤波电路输出电压计算公式如下：

完成各个模块电路的设计即可进行系统PCB 板的焊接，其实物图如图8 所示。

图8 系统PCB 实物

4.2 软件设计

嵌入式系统程序设计主要包括系统各项功能初始化、指令的发送和信号的接收，解析接收的指令，并执行对应的功能，保证整个系统的有序运行。系统运行后，主程序调用初始化函数，对单片机I/O 口、复用映射、定时器、串口、中断及中断优先级等参数进行初始化设置。系统初始化完成后，等待指令的传入，并对接收到的指令进行判断，然后解析指令完成相应的操作。系统主程序的功能主要包括触摸屏显示、信号检测、数据的处理和存储等。系统主程序流程如图9 所示。

图9 系统主程序流程图

5 实验结果及分析

5.1 横向流动免疫分析平台可行性测试

为测试电化学集成检测平台的可行性，选用大肠杆菌O157：H7 溶液和纯净水作对照组，利用电化学工作站进行电化学检测，测试结果如图10 所示。

图10 可行性测试结果

由图10 可知，在滴加阴性溶液时，电化学集成横向免疫分析平台几乎不产生电流响应。滴加含有大肠杆菌O157：H7 的溶液时，平台在0.1～0.4 V 范围内有较明显的电流响应，并且在0.2～0.3 V 之间取最大值。综上所述，电化学集成横向免疫分析平台能明显区分阴性、阳性，有较好的可行性。

5.2 横向流动免疫分析平台灵敏性测试

实验配置10 组浓度分别为0、101CFU/mL、102CFU/mL、103CFU/mL、104CFU/mL、105CFU/mL、106CFU/mL、107CFU/mL、108CFU/mL、109CFU/mL 的大肠杆菌O157：H7 溶液，滴入电化学集成免疫分析平台样品垫检测，检测结果如图11 所示。

图11 灵敏性测试结果

从图中可以看出，电流响应强度随大肠杆菌O157：H7 溶液浓度的增加而增强，并且不同浓度之间表现出明显的差异，说明电化学集成免疫分析平台具有较好的灵敏性。

5.3 横向流动免疫分析平台特异性测试

实验准备4 组浓度为106CFU/mL 的大肠杆菌O157：H7、沙门氏菌、金黄葡萄球菌、李斯特菌溶液，在相同条件下进行电化学检测，结果如图12 所示。

图12 特异性测试结果

从图中可以看出，大肠杆菌O157：H7 电流响应非常明显，沙门氏菌有轻微的电流响应，其他菌种几乎无电流响应，说明电化学集成免疫分析平台具有较好的特异性。

5.4 浓度表达式拟合

为得到检测电信号大小与物质浓度之间的关系，配制9 组浓度为101CFU/mL、102CFU/mL、103CFU/mL、104CFU/mL、105CFU/mL、106CFU/mL、107CFU/mL、108CFU/mL、109CFU/mL 的标准液样品，滴入测试条进行电化学检测。根据电流信号与待测样品浓度关系，用最小二乘法做线性回归，拟合曲线如图13 所示。

图13 大肠杆菌浓度检测拟合结果

由图可知，电流强度的大小与待测物浓度有明显线性关系，线性拟合后，检测公式如下：

在检测范围102～109CFU/mL 浓度内，线性拟合度R2=0.985 2，电流强度与大肠杆菌O157：H7溶液浓度有良好的线性拟合度。

5.5 系统误差测试

在进行误差测试时，使用上海辰华仪器有限公司生产的电化学工作站分别对浓度为102CFU/mL、103CFU/mL、104CFU/mL、105CFU/mL、106CFU/mL、107CFU/mL、108CFU/mL、109CFU/mL 的标准液样品进行电化学检测，测试过程重复5 次，取平均值记录，测试数据如表1 所示。

表1 系统误差测试数据

根据表1可知，本系统检测相对误差小于4.5%，准确性较好。

5.6 系统重复性测试

系统的重复性测试是衡量检测仪器稳定性的重要指标，是对检测结果离散程度的反应。重复性常采用变异系数CV值表示，其计算公式如下：

式中，σ表示样本标准差；表示样本均值。计算得到的CV值越小，则表示系统检测重复性检测越稳定。

进行系统重复性检测时，实验室配置标准液浓度103CFU/mL、106CFU/mL、109CFU/mL 三种浓度指标进行测试，每组测试重复10 次，并计算检测样本浓度均值以及标准差，进行系统重复性测试。通过计算，CV值分别为3.7%、2.1%、0.3%，结果表明随着检测浓度的升高，变异系数越小，系统检测结果越稳定。实验结果的测试曲线如图14 所示。

图14 系统重复性测试结果

6 结论

本系统采用电化学免疫分析技术，设计电化学集成横向流动免疫分析平台，选用STM32F407微处理器作为系统控制核心，实现对食品溶液中大肠杆菌O157：H7 的快速定量检测。该系统体积小，操作简单，只需“一键式”操作，即可在10 min 内得到检测结果，适合家用普及。实验结果表明，该系统的检测误差小于4.5%，系统重复误差小于3.7%，检测限达到102CFU/mL，可有效用于大肠杆菌O157：H7 的检测。