肝龙胶囊对Balb/c裸鼠腋下移植瘤的影响

杨逸鑫 王彦权 彭芳

[摘要] 目的 探讨肝龙胶囊对Balb/c裸鼠腋下移植瘤的影响。方法 将人肝癌敏感株BEL-7402接种于裸鼠腋下造模，造模成功后将其分为模型组、索拉非尼组、CII-3组、脱脂膏组、肝龙胶囊高、中、低剂量组，正常裸鼠为空白组，连续给药14d。比较各组的抑瘤率、脏器指数、生化指标、缺氧微环境相关蛋白及其mRNA表达水平。结果 各药物治疗组均能抑制肿瘤生长，其中肝龙胶囊中剂量组的平均抑瘤率最高；与模型组相比，各药物治疗组裸鼠的心脏指数、肾脏指数、肝脏指数、肺脏指数均有所升高，脾脏指数均有所下降，但多数变化不大；各项生化指标显示，肝龙胶囊安全性良好，并未出现明显的组织损伤；索拉非尼组、肝龙胶囊中剂量组裸鼠的低氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和血管內皮生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）的mRNA表达均显著低于模型组（P<0.05）；免疫组织化学结果显示，各药物治疗组的VEGFR2、HIF-1α、VEGF、Ki-67和CD31蛋白表达均表现出不同程度的抑制，其中以索拉非尼组、肝龙胶囊中剂量组及CII-3组的抑制作用较强。结论 肝龙胶囊可有效抑制Balb/c裸鼠腋下移植瘤的生长，并下调移植瘤中缺氧微环境相关蛋白及其mRNA表达水平。

[关键词] 肝龙胶囊；肝癌；腋下移植瘤；美洲大蠊

[中图分类号] R965.2      [文献标识码] A    [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2024.04.018

Effect of Ganlong capsule on axillary graft tumour in Balb/c nude mice

YANG Yixin1，2， WANG Yanquan1，2， PENG Fang1，2

1.College of Pharmacy， Dali University， Dali 671000， Yunnan， China; 2.Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D， Dali 671000， Yunnan， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of Ganlong capsule on axillary graft tumour in Balb/c nude mice. Methods BEL- 7402， a human hepatocellular carcinoma sensitive strain， was inoculated into the armpit of nude mice for modeling. After successful modeling， mice were divided into model group， sorafenib group， CII-3 group， degreasing cream group， and Ganlong capsule high-dose， medium-dose and low-dose groups， and normal nude mice were included in blank group. All groups were given continuous administration for 14 days. The tumor inhibition rate， organ index， biochemical index， anoxic microenvironment related proteins and their mRNA expression levels were compared among all groups. Results All drug treatment groups could inhibit tumor growth， and the average tumor inhibition rate was the highest in Ganlong capsule medium-dose group. Compared with the model group， the heart index， kidney index， liver index and lung index of nude mice in all drug treatment groups were increased， and the spleen index were decreased， but most of the changes were little. Various biochemical indexes showed that Ganlong capsule was safe and did not cause obvious tissue damage. The mRNA expressions of hypoxia-inducible factor-1α （HIF-1α）， vascular endothelial growth factor （VEGF） and vascular endothelial growth factor receptor 2 （VEGFR2） in sorafenib group and Ganlong capsule medium-dose group were significantly lower than those in model group （P<0.05）. Immunohistochemical results showed that all drug treatment groups showed different degrees of inhibition on VEGFR2， HIF-1α， VEGF， Ki-67 and CD31 protein expressions， among which sorafenib group， Ganlong capsule medium-dose group and CII-3 group had stronger inhibitory effects. Conclusion Ganlong capsule can effectively inhibit the growth of axillary graft tumour in Balb/c nude mice， and down-regulate the expression level of hypoxic microenvironment related protein and their mRNA in the graft tumor.

[Key words] Ganlong capsule; Hepatocellular carcinoma; Axillary graft tumor; Periplaneta Americana

肝细胞癌是目前我国第4位常见恶性肿瘤及第2位肿瘤致死病因，严重威胁我国人民的生命和健康[1-3]。2020年，我国肝癌年新发病例达41万人，占全球45.3%，死亡39.1万人，占全球47.1%[4-6]。乙型肝炎病毒和（或）丙型肝炎病毒感染、过度饮酒、非酒精性脂肪性肝炎、其他原因引起的肝硬化及有肝癌家族史者均为肝癌高危人群[1]。乙型肝炎是肝癌重要的发病因素，肝纤维化可演变为慢性肝硬化，最终导致肝癌发生。肝龙胶囊是国家药品监督管理局（National Medical Products Administration，NMPA）批准的治疗乙型肝炎的二类中药新药，由美洲大蠊提取物研制而成，其主要活性成分为黏氨糖，具有疏肝理脾、活血解毒及抗肝纤维化作用[7]。肝癌的发生与慢性肝炎、肝硬化有关。研究显示，同样来源于美洲大蠊的两种粗提物（CII-3和脱脂膏）对恶性肿瘤有着不错的疗效，由此推测肝龙胶囊可能在治疗肝癌方面具有同样的效果。本研究拟观察肝龙胶囊是否具有治疗肝癌的作用，现将结果报道如下。

1  材料与方法

1.1  实验动物、细胞、主要药品及器材

7～9周SPF级Balb/c裸鼠，体质量18～22g，64只，雌雄各半，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号：430727200101104518。人肝细胞癌敏感细胞株BEL-7402（MXC050）由上海美轩生物科技有限公司提供。美洲大蠊粗提物脱脂膏、美洲大蠊粗提物CII-3由大理大学药学院提供；肝龙胶囊（批准文号：国药准字Z20050113，生产单位：昆明赛诺制药股份有限公司，规格：每粒重0.3g，含美洲大蠊提取物0.15g）；索拉非尼（批号：1017R021）购自北京索莱宝科技有限公司；尿素氮测试盒、超氧化物歧化酶试剂盒、小鼠血清肌酐试剂盒、丙氨酸转氨酶试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）逆转录试剂盒、PCR荧光试剂盒均购自上海碧云天生物科技有限公司。

1.2  实验方法

1.2.1  药液配制  肝龙胶囊、CII-3、脱脂膏用生理盐水稀释至实验所需浓度并过滤后使用；索拉非尼与羧甲基纤维素钠、甘油混合，配制成浓度为3mg/ml的索拉非尼混悬胶浆备用。

1.2.2  裸鼠皮下移植瘤模型的建立及分组给药  Balb/c裸鼠适应性饲养1周后，于左前肢腋下注射含有5×107个BEL-7402细胞株的细胞悬液，其后放置SPF级动物房饲养1周，直至裸鼠腋下肿瘤组织体积达到100mm3。将造模成功的裸鼠分为模型组、索拉非尼组（给予索拉非尼30mg/kg）、CII-3组（给予CII-3 200mg/kg）、脱脂膏组（给予脱脂膏200mg/kg）、肝龙胶囊高、中、低剂量组（分别给予肝龙胶囊360mg/kg、180mg/kg、90mg/kg），同时选取正常裸鼠作为空白组，每组各8只，造模成功后第7天开始按上述给药剂量进行灌胃给药（0.1ml/10g），模型组和空白组给予等体积生理盐水，均连续给药14d。

1.2.3  对裸鼠腋下移植瘤抑瘤率及脏器指数的影响  实验结束后颈椎脱位处死裸鼠，摘取心、肝、脾、肺及肾，剥离腋下移植瘤，检测脏器指数及抑瘤率[8]。抑瘤率（%）=（模型组瘤重–给药组瘤重）/模型组瘤重×100%。脏器指数=脏器质量（mg）/体质量（g）。

1.2.4  对裸鼠生化指标的影响  实验结束后眼眶静脉丛取血，按试剂盒说明书检测各组裸鼠的肌酐清除率、尿素氮、转氨酶、超氧化物歧化酶水平。

1.2.5  对裸鼠腋下移植瘤缺氧微环境相关蛋白及其mRNA表达水平的影响  实时荧光定量PCR法检测各组裸鼠腋下移植瘤肿瘤组织缺氧微环境中低氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血管内皮生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）mRNA表达水平；免疫组织化学染色法检测各组裸鼠腋下移植瘤缺氧微环境中相关蛋白HIF-1α、VEGF、VEGFR2、Ki-67、CD31的表达水平。

1.3  统计学方法

应用SPSS 18.0软件对实验数据进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，組间比较采用单因素方差分析；计数资料以例数（百分率）[n（%）]表示，比较采用χ2检验。数据图使用Graphpad Prism 8软件进行绘制。P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1  对裸鼠腋下移植瘤生长的影响

与模型组比较，不同药物处理后裸鼠的肿瘤瘤重均呈下降趋势，且索拉非尼组和肝龙胶囊中剂量组的肿瘤瘤重均显著低于模型组（P<0.05），肝龙胶囊中剂量组的平均抑瘤率最高，见表1。

2.2  对裸鼠腋下移植瘤脏器指数的影响

与模型组相比，各药物治疗组裸鼠的心脏指数、肾脏指数、肝脏指数、肺脏指数均有所升高，脾脏指数均有所下降，多数变化不大，见表2。

2.3  对裸鼠生化指标的影响

与空白组相比，模型组和各治疗组裸鼠的尿素氮、肌酐水平均显著降低（P<0.05）；除脱脂膏组外，各治疗组裸鼠的丙氨酸转氨酶水平均显著高于空白组（P<0.05）；除肝龙胶囊低、高剂量组外，各治疗组裸鼠的天冬氨酸转氨酶水平均显著低于空白组和模型组（P<0.05），见表3。

2.4  对裸鼠腋下移植瘤组织缺氧微环境相关蛋白mRNA表达水平的影响

索拉非尼组、肝龙胶囊中剂量组和脱脂膏组裸鼠的HIF-1α mRNA表达均显著低于模型组（P<0.05）；索拉非尼组和肝龙胶囊中剂量组裸鼠的VEGF mRNA和VEGFR2 mRNA表达均显著低于模型组（P<0.05），见表4。

2.5  对裸鼠腋下移植瘤组织缺氧微环境相关蛋白表达的影响

免疫组织化学染色结果显示：各药物治疗组对VEGFR2、HIF-1α、VEGF、Ki-67和CD31蛋白表达均表现出不同程度的抑制作用，其中以索拉非尼组、肝龙胶囊中剂量组及CII-3组的抑制作用较强，见图1。

3  讨论

肿瘤微环境成分复杂，包含多種细胞及其他非转化型细胞，其特点是缺氧、低pH值和高还原性，其中缺氧是大多数实体瘤的典型特征[9-11]。肿瘤细胞和肿瘤微环境之间相互影响，在促进肿瘤细胞生长的同时也能抑制免疫细胞的活性[12]。

HIF-1α是肿瘤对缺氧适应性反应的重要触发因素[13]。研究表明，HIF-1α在肝癌中高度表达，肿瘤组织缺氧越严重，HIF-1α表达越高[14-15]。HIF-1α可通过激活下游基因促进肿瘤细胞的生长且抑制细胞凋亡，其在肝癌和基质形成中起重要的转录调控作用。

VEGF的表达需要HIF-1α的激活，即使在缺氧的情况下也是如此[16]。VEGFR是特异性结合VEGF的高亲和力受体，其亚型VEGFR2在血管内皮的形成中发挥至关重要的作用；它可抑制内皮细胞凋亡，在一定程度上增加血管通透性[17]。研究表明，VEGF与肝癌的发生和发展密切相关，肝癌组织中VEGF阳性表达率显著高于其他相邻或非相邻的实质组织[18]。

本研究结果显示，各治疗组在一定程度上均可抑制裸鼠肝癌移植瘤的生长，提高脏器指数（除脾脏指数外），以索拉非尼组和肝龙胶囊中剂量组效果最好；各项生化指标显示，肝龙胶囊安全性良好，并未出现明显的组织损伤；索拉非尼组和肝龙胶囊低、中、高剂量组均可降低裸鼠肿瘤组织中HIF-1α、VEGF和VEGFR2 mRNA的表达量，其中以索拉非尼组和肝龙胶囊中剂量组效果显著，提示索拉非尼组和肝龙胶囊中剂量组具有下调体内上述3种缺氧微环境相关蛋白mRNA的能力。

免疫组织化学染色结果表明，与模型组相比，各治疗组均可抑制裸鼠腋下移植瘤内HIF-1α、VEGF、VEGFR2、Ki-67、CD31蛋白的表达；其中索拉非尼组、肝龙胶囊中剂量组及CII-3组对HIF-1α、VEGFR2、Ki-67蛋白表达的抑制作用效果较好；索拉非尼组对VEGF蛋白表达的抑制效果最优；肝龙胶囊中剂量组和CII-3组对CD31蛋白表达的抑制效果较为显著，且优于索拉非尼组。

综上，肝龙胶囊可有效抑制Balb/c裸鼠腋下移植瘤的生长，诱导肿瘤细胞凋亡，且下调裸鼠移植瘤缺氧微环境相关蛋白及其mRNA的表达水平。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。

[参考文献]

[1] 中华人民共和国国家卫生健康委员会医政医管局. 原发性肝癌诊疗指南（2022年版）[J]. 中华肝脏病杂志， 2022， 30（4）： 367–388.

[2] ZHOU M， WANG H， ZENG X， et al. Mortality， morbidity， and risk factors in China and its provinces， 1990-2017： A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017[J]. Lancet， 2019， 394（10204）： 1145–1158.

[3] CHEN W， ZHENG R， BAADE P D， et al. Cancer statistics in China， 2015[J]. CA Cancer J Clin， 2016， 66（2）： 115–132.

[4] 刘宗超， 李哲轩， 张阳， 等. 2020全球癌症统计报告解读[J]. 肿瘤综合治疗电子杂志， 2021， 7（2）： 1–13.

[5] 周家琛， 郑荣寿， 王少明， 等. 2020年中国和世界部分国家主要消化道肿瘤负担比较[J]. 肿瘤综合治疗电子杂志， 2021， 7（2）： 26–32.