结直肠癌中FOXA3的表达及其临床意义

陈宇晶,汪静宇,张 琳,王 振

结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤[1-3],其发病机制尚未完全阐明。近期研究发现,叉头框家族蛋白(forkhead box proteins, FOX)亚家族A3(FOXA3)与肺癌、胰腺癌、肝癌、食管癌等肿瘤的发生、发展密切相关[4-5],但目前有关FOXA3在结直肠癌中作用的研究还较少。本实验通过RNA测序,发现FOXA3在结直肠癌组织中的表达高于癌旁组织,GEPIA数据库生物信息学分析发现,FOXA3在结直肠癌组织中的表达高于癌旁组织。结果提示,FOXA3可能在结直肠癌的发生、发展中起一定作用。本文通过分析结直肠癌组织中FOXA3的表达及其与临床病理特征的关系,探讨FOXA3在结直肠癌发生、发展中的临床意义,旨在为结直肠癌的机制研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料收集2017年12月～2019年1月浙江省嘉兴市第一医院手术切除的结直肠癌组织和配对癌旁正常组织标本31对(其中男性17例,女性14例)进行mRNA表达检测。所有标本术后立即放入液氮中冷冻,然后保存于-80 ℃冰箱,直至RNA被提取。另收集2009年1月～2010年12月嘉兴市第一医院手术切除的结直肠癌组织120例(其中男性69例,女性51例)进行免疫组化检测,标本均经10%中性福尔马林固定,石蜡包埋。所有患者术前均未行化疗或放疗等治疗。结直肠癌病理诊断均由两名病理诊断医师独立完成。本研究经嘉兴市第一医院伦理委员会批准(伦理号LS2018-204),患者均知情同意。

1.2 主要试剂组织RNA提取试剂盒(货号74106,美国QIAGEN公司);RNA逆转录试剂盒(货号RR037A,大连宝生物公司),实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测试剂盒(货号RR420A,大连宝生物公司);兔抗人FOXA3多克隆抗体(货号Ab238112,稀释比1 ∶100,美国Abcam公司);免疫组化检测试剂盒(货号K5007,丹麦Dako公司)。

1.3 方法

1.3.1生物信息学分析 使用GEPIA数据库(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)分析TCGA数据(结肠癌组织275例,配对正常组织349例,直肠癌组织92例,配对正常组织318例)。在Single Gene Analysis模块中输入基因名FOXA3,点击“GoPIA!”,选择Expression DIY中的Box plot模块进行分析。“Datasets Selection”框选择结肠癌和直肠癌,其他选项为默认选项,点击“Plot”分析数据,下载PDF箱式图。

1.3.2RT-qPCR 用匀浆机将组织打碎后,采用组织RNA提取试剂盒(QIAGEN公司)提取新鲜结直肠癌组织和癌旁正常组织中的RNA,随后用逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA(逆转录反应条件为37 ℃ 45 min,85 ℃ 5 min,4 ℃保存)。用GAPDH基因作为内参照,采用RT-qPCR技术检测FOXA3基因表达量。GAPDH和FOXA3引物序列来自美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI),引物合成由上海生工公司完成。GAPDH引物序列:上游5′-ACCACAGTC CATGCCATCAC-3′,下游5′-TCCACCACCCTGTT GCTGTA-3′,扩增长度为452 bp。FOXA3引物序列:上游5′-GAGATGCCGAAGGGGTATCG-3′,下游5′-ACCTTGACGAAGCAGTCGTT-3′,扩增长度为224 bp。RT-qPCR检测使用大连宝生物公司的SYBR荧光试剂盒,反应体系为10 μL,仪器为Stepone plus荧光定量PCR仪(ABI公司),每个样本均做3个复孔,统计平均值。采用2-ΔΔCt法计算FOXA3基因相对表达量。

1.3.3免疫组化 免疫组化染色采用EnVision两步法,用PBS代替一抗作为阴性对照。FOXA3表达定位于细胞核。评分根据DAB显色结果,采用免疫反应分数(immunoreactive scores, IRS)进行评分,IRS以阳性细胞百分比×染色强度分数表示[6]。(1)按阳性细胞百分比评分:无阳性细胞为0分,阳性细胞数<10%为1分,10%～50%为2分,51%～80%为3分,>80%为4分。(2)按染色强度评分:无阳性着色为0分,淡黄色为1分,黄色为2分,棕黄色为3分。IRS<6分为低表达,≥6分为高表达。

2 结果

2.1 结直肠癌和癌旁正常组织中FOXA3 mRNA的表达(1)RNA测序分析:将3对结直肠癌组织和配对癌旁正常组织进行FOXA3 mRNA测序,结果显示结直肠癌组织中FOXA3 mRNA的表达明显高于癌旁正常组织(表1)。(2)生物信息学分析:GEPIA数据库分析显示,FOXA3在结肠癌和直肠癌中的表达均高于癌旁正常组织(图1)。(3)PCR验证:RT-qPCR检测结果显示,31例结直肠癌组织中FOXA3 mRNA表达显著高于癌旁正常组织(t=2.952,P=0.006 1,图2)。

图1 生物信息学分析结直肠癌组织和癌旁正常组织中FOXA3 mRNA的表达,*P<0.05

图2 结直肠癌组织和癌旁正常组织中FOXA3 mRNA的表达

表1 3对结直肠癌组织和癌旁正常组织中FOXA3 mRNA测序分析

2.2 FOXA3蛋白表达与结直肠癌临床病理特征的关系采用免疫组化法检测120例结直肠癌组织中FOXA3蛋白表达(图3),统计分析显示,FOXA3表达与淋巴结转移呈正相关,高表达FOXA3的患者易发生淋巴结转移(P=0.002)。FOXA3表达与组织分化程度呈负相关,高表达FOXA3的患者组织分化程度低(P=0.006)。FOXA3表达与患者性别、年龄、发病部位、肿瘤大小和组织类型均无关(表2)。

AB

表2 FOXA3蛋白表达与结直肠癌临床病理特征的关系[n(%)]

2.3 FOXA3表达与结直肠癌患者预后的关系单因素生存分析显示,淋巴结转移、分化程度和FOXA3表达与预后相关(表3),有淋巴结转移者预后差(P<0.000 1),肿瘤分化程度低的患者预后差(P=0.049),高表达FOXA3的患者预后差(P=0.001)。Kaplan-Meier生存分析显示,FOXA3低表达患者总生存期高于FOXA3高表达患者(图4)。

图4 Kaplan-Meier生存曲线分析FOXA3表达与结直肠癌患者预后的关系

表3 Cox回归模型分析结直肠癌预后危险因素

将Cox单因素生存分析有统计学意义的淋巴结转移、分化程度以及FOXA3表达等指标纳入Cox多因素分析,同时将性别、年龄作为校正因素纳入分析,结果显示,FOXA3表达是结直肠癌的独立预后因素(HR=0.453,95%CI=0.209～0.982,P=0.045,表3)。

3 讨论

叉头框家族蛋白拥有一段保守的110个氨基酸组成的DNA结构域[7],包含19个亚家族,由100多个成员组成,分别以FOXA-FOXS命名。FOX家族中FOXA是作用最广泛、研究最深入的一个亚家族,广泛存在于真菌和动物体内,该家族蛋白在胚胎发育、细胞分化、能量代谢以及免疫调节等均发挥重要的生理作用。FOXA由FOXA1、FOXA2和FOXA3三个成员组成,FOXA3也叫FKHH3、HNF3G或TCF3G,人类FOXA3定位于染色体19q13.32。

近年,FOXA3在癌症中作用的研究越来越受到重视。研究表明,FOXA3在肝癌、食管癌、肺癌、子宫内膜癌等癌症的发生、发展中均起到一定作用[8-19]。Zhou等[11]研究发现,FOXA3在肝癌组织中的表达显著降低,FOXA3降低可能是由甲基转移酶METTL14介导的m6A甲基化修饰所调控。FOXA3高表达患者总生存率高。另有研究团队[12-13]也得到类似的结果,他们发现FOXA3可与HNF1A、HNF4A协同作用,使肝癌细胞丧失恶性特征,从而抑制肝癌细胞的生长。Wang等[14]研究发现,lncRNA DACT3-AS1可通过促进FOXA3和HDAC2相互作用,使FOXA3去乙酰化,降低FOXA3的表达,导致FOXA3抑制PKM2的作用降低,促进肝癌的发生和转移。但也有研究发现[15],FOXA3可以通过上调AFP和HNF1A/MYC和下调ZFHX3的表达,促进肝母细胞瘤的发生、发展。上述研究提示,FOXA3在肝癌的发生、发展中可能通过不同调控机制在抑癌和促癌中起双重作用。

Huang等[16]研究发现,FOXA3在肺癌组织中表达水平升高,且患者总生存率较差。Guo等[4]推测FOXA3可能与突变的KRAS协同诱导侵袭性肺黏液腺癌(invasive mucinous adenocarcinoma, IMA)的发生。这表明FOXA3在肺癌的发生、发展中可能起促癌作用。

FOXA3在食管癌中的作用也有相关研究。Chen等[17]研究发现,与正常组织相比,FOXA3在食管癌和Barrett食管组织中的表达显著上调,FOXA3上调与肿瘤侵袭和晚期TNM分期显著相关。进一步体外实验发现,FOXA3下调能显著抑制食管癌细胞的迁移和侵袭能力。但张偲昂[18]的研究结果发现FOXA3在食管鳞癌中显著下调,FOXA3低表达患者与淋巴结转移密切相关,FOXA3低表达是患者预后不良的独立危险因素,上调FOXA3的表达,食管鳞状细胞癌的增殖能力和迁移能力显著下降。这些研究表明,与肝癌类似,FOXA3可能在食管癌的发生、发展中通过不同机制起促癌和抑癌的双重作用。

目前,有关FOXA3在结直肠癌中作用的研究报道较少。Li等[20]研究发现,FOXA3在奥沙利铂治疗敏感的结直肠癌患者癌组织中的表达比耐药患者癌组织中的表达显著上调。FOXA3表达下调的患者,总生存率或无瘤生存率均较差。FOXA3表达下调可显著提高结直肠癌细胞的存活和干细胞样特性。进一步机制研究表明,在结直肠癌中FOXA3对奥沙利铂化疗敏感是通过抑制结肠癌转移相关基因1(metastasis-associated in colon cancer 1, MACC1)实现的。该研究提示,FOXA3可能在结直肠癌的发生、发展中起抑癌作用。

本研究通过生物信息学分析发现,FOXA3 mRNA在结直肠癌组织中的表达显著高于癌旁组织。RT-qPCR检测结果与之一致,提示FOXA3在结直肠癌的发生、发展中可能起到一定的作用。进一步采用免疫组化法检测FOXA3表达与结直肠癌临床病理特征的关系,发现FOXA3表达与淋巴结转移呈正相关,高表达FOXA3的患者易发生淋巴结转移。FOXA3表达与组织分化程度呈负相关,高表达FOXA3的患者组织分化程度低,而FOXA3表达与患者性别、年龄、发病部位、肿瘤大小和组织类型均无关。Cox单因素生存分析显示,FOXA3表达与预后相关,高表达FOXA3的结直肠患者预后差,生存期短(P=0.001)。Cox多因素分析显示,FOXA3表达是结直肠癌患者独立的预后指标。

研究表明[21],癌症的发生、发展是多基因、多分子、多通路间错综复杂、相互作用的结果,同一基因可能通过参与不同机制在癌症的发生、发展中起到抑癌和促癌的双重作用。本研究推测FOXA3在结直肠癌的发生、发展中可能起促癌作用,而上述Li等的研究表明FOXA3可能通过抑制肿瘤干性和增强化疗敏感在结直肠癌中起抑制作用,提示其与FOXA3在肝癌、食管癌等消化系统肿瘤中的双重作用类似,FOXA3在结直肠癌的发生、发展中也可能起抑癌和促癌的双重作用,这种双重作用可能与信号通路、肿瘤代谢和免疫微环境等差异相关。总之,FOXA3在结直肠癌发生、发展中的复杂性、确切的功能和机制还需积累更多的研究加以补充和完善。

本研究通过探讨FOXA3表达与结直肠癌临床病理特征的关系,发现FOXA3可能在结直肠癌的发生、发展过程中发挥重要作用。FOXA3高表达可能会促进结直肠癌的转移,导致预后不良,这些促癌现象的发现是对FOXA3在结直肠癌中的作用有益补充,为进一步研究FOXA3的功能和机制提供了良好的理论基础和方向,并可能为结直肠癌的早期诊断和个体化靶向治疗提供新的靶点,对结直肠癌的防治具有重要意义。