疫苗生产过程中预防支原体污染的方法

文│刘召明 杨香芳 刘兆霞 申茂欣 王琳 吴太航（青岛易邦生物工程有限公司）

兽用疫苗的生产过程通常会涉及细胞培养，而在细胞培养过程中非常容易被支原体污染，影响细胞的正常形态和遗传，进而对疫苗制品的质量与安全造成严重的负面影响，破坏疫苗的正常免疫效力，甚至会给动物造成严重的危害。笔者简单阐述了在疫苗生产过程中的重点检测目标、疫苗生产中常见的污染物、支原体常用的检测方法，同时还对有效预防支原体污染提出了几点建议，以供相关人员参考。

我国是畜禽养殖大国，对兽用疫苗的需求量非常大，作为疾病预防的特殊药物，兽用疫苗在养殖业中发挥着非常重要的作用。但由于疫苗生产过程的特殊性，特别是组织活疫苗或者细胞苗等非常容易受到支原体的污染，进而影响疫苗的正常效用，甚至会对畜禽产生严重的危害，对畜牧养殖业造成一定的损失。兽用疫苗无论是从研发开始、还是生产，甚至是在产品应用过程中均存在一定的生物安全风险。因此，兽用疫苗的生物安全与控制受到了相关部门的高度关注，要加大行业的监管力度，确保兽用疫苗的品质，需要在其生产过程中进行正确检测，加强疫苗生产过程中支原体污染的预防工作，以促进畜牧养殖业的健康发展。

一、兽用疫苗生产过程中的检测目标

1.疫苗GMP认证与检查。兽用疫苗生产企业必须具有相关的生产资质，符合药品GMP认证检查要求，同时还需满足质检部门对其进行的跟踪检查，并能对提出的缺陷项目进行整改、落实。

2.对生产环境的检测。疫苗生产厂家需要重点关注生产车间的空气净化系统，包括温度、湿度、通风换气的次数、风速、压强、尘埃粒子指数、微生物含量以及自净时间等控制标准的检测，科学制定检测周期，如检测结果出现偏差需立即进行整改处理；其次，对厂房的清洁消毒进行周期性检查，特别是生产使用的高效过滤器是否符合生产标准，按照相关更换标准和更换周期进行使用。

3.对生产药液的检测。疫苗生产过程中，药液的配制、灭菌及除菌过滤环节非常关键，灭菌或者除菌过滤的时间、操作环境及分装过程均会影响疫苗质量。检测过程中需重点关注疫苗生产后待冻干中间产品的滞留时间以及无菌过滤器的完整性是否符合国家生产标准；此外，还需检测待灭菌中间产品含有的污染菌总数，如需氧菌和耐热孢子等是否符合相关规定标准。

4.对后续分装、质检的检测。同属同一分装车间的不同的疫苗制品均应该具有GMP证书，相关分装容器、消毒和清洁制剂等需满足防治污染的要求。重点检测同一操作区域内同时工作的分装机器所生产的产品，必须明确生产批号，不可发生混淆的现象。质检部门需要严格按照检测要求对疫苗的原料、辅料、中间产品以及成品等进行全项检查，可根据规定进行抽检，同时按规留样、观察。企业所产均需留有批次记录，必须严格覆盖疫苗企业常年生产的所有疫苗品种，并且每一种最少要具有3批抽查记录，不足3批的则需进行全部检查。

二、疫苗生产中的常见污染物

支原体是一种个体非常小、不具有细胞壁、形态多样的原核微生物。该微生物具有特殊的结构，通常情况下可以通过滤菌器时附着于宿主的细胞膜上，然后与宿主细胞膜上相应的受体相结合，导致其细胞膜结构发生改变，促使宿主细胞产生一些异常的细胞因子，影响宿主的正常免疫反应，而引发多种疾病。我国生产的普通疫苗以及细胞活毒疫苗等非常容易受到支原体的污染，影响疫苗的质量和生物安全性，给疫苗生产企业造成较大的经济损失，若这类疫苗流入药物市场还会给畜禽疫病防控工作带来严重损害。我国对所有由细胞产生的活疫苗进行了相关规定，不能在其中检测到被支原体污染的情况。因此，在对兽用疫苗生产过程进行检测时需加强对支原体的检测，确保相关生产工作能顺利展开。

三、支原体的常用检测方法

1.传统检测方法。

（1）直接培养法。取待检测的样品直接接种到支原体培养基上，随后仔细观察液体培养基是否发生颜色变化，或者观察固体培养基上的支原体菌落情况，最后将观察到的结构进行分析、判断，这种检测方法虽然准确率很高，但需要很长的培养时间，对培养基的营养水平要求较高，而且不能将同一个培养基中生长的支原体类型进行检测区分。直接培养法通常用于种毒以及成品检测。

（2）DNA荧光染色法。DNA荧光染色法又被称为指示细胞法，与培养法不同，这一检测方法耗时较短，同时可对多个样品进行检测，还可对培养法不能检出的支原体进行判断。有条件的企业可以在配制疫苗前就使用该方法进行支原体污染的初步检测，直接筛选不合格的样品。

2.血清学检测法。

（1）被动颗粒凝集试验（PPA）。该方法主要应用于细菌和支原体的鉴定以及对抗体的定性检测。该方法具有操作简单、高精确度和敏感度的优点，可以广泛应用到临床检测中。

（2）酶联免疫吸附法（ELISA）。ELISA检测法是当前实验室中检测病原体最常用的方法之一，也是诊断人和动物支原体感染的方法之一。该方法操作简单、特异性和敏感性均比较强。

3.分子生物学技术。

（1）PCR检测技术。随着生物分子学的深入发展，人们逐渐加深了对支原体核酸结构、分子组成以及特异性的了解，通过使用PCR技术能非常快速、灵敏地检测到支原体，同时该检测方法还具有较高的特异性，在兽医生物制品中得到了非常广泛的运用和推广。但这种检测方法对检测环境和仪器的要求较高，容易发生交叉感染，在检测中必须提高重视程度。

（2）DNA分子杂交检查法。由于原核生物的rRNA具有非常高的保守性，采用DNA分子杂交技术可以特异性地检测出污染的支原体的种类。

四、预防支原体污染的方法

1.添加抗生素。在细胞活毒疫苗生产过程中，可以通过添加适量的抗生素来预防、控制支原体造成的疫苗污染。但需要注意的是，在使用抗生素前需进行药敏试验，筛选出合适的抗生素种类和剂量后再添加。

2.严格灭菌消毒。生产过程中使用的一切物品均需要进行彻底的清洗与消毒处理，同时对使用的各种溶液进行严格的高压灭菌处理，确保在进行无菌试验检测结果呈阴性后再使用。对操作室和剩余的耗材等均需要进行定期的清洁、消毒及灭菌。

3.规范操作流程。生产操作者在进入无菌室前要严格按照疫苗生产GMP的要求使用肥皂洗手，并且按照相关规定穿戴无菌服和无菌帽。在生产工作开始前还需使用浓度为75%的酒精擦拭手、瓶口，同时对瓶口进行灼烧。其次，无菌室内的操作者要尽量减少走动，并且动作要轻，打开瓶口时需要在火焰周围的无菌区域内打开，同时转动灼烧的瓶口。需特别注意使用吸管前要更换新管，若在操作时吸管口接触了手或者其他污染物品需要及时弃掉更换。每次试验结束后都需要使用消毒剂擦拭操作台面。

4.避免细胞间交叉污染。在同一操作室同时进行多种细胞培养时需将所使用的器具进行严格区分。特别是在换液或者细胞传代操作时使用的注射器和滴管等不可以接触到细胞培养瓶的瓶口，防止将培养的细胞带入培养液中污染其他细胞。

5.无菌室严格消毒。首先可使用浓度为0.1%的新洁尔灭溶液无菌操作室进行彻底的擦拭消毒，并且在每次生产工作开始前对生产线进行臭氧消毒；甲醛属于广谱消毒剂，可以对水溶液、气体中的各种细菌、芽孢和真菌等病原微生物起到良好的杀菌作用，在日常生产中可对生产线进行定期的甲醛熏蒸消毒。

6.对生物制品进行定期支原体污染检测。对兽用疫苗需要定期检测，如发现有被支原体污染的情况需及时对其灭活处理，避免造成更广泛的传播。

五、结语

综上所述，在疫苗生产过程中非常容易受到支原体污染，感染支原体后的细胞会在形态和遗传物质方面发生一定的改变，进而在一定程度上影响宿主细胞的免疫能力，破坏疫苗应有的特异性免疫保护效力，甚至对使用的动物造成严重的副作用。因此，在疫苗生产过程中需要进行正确的质量检测，使用科学的检测技术对生物制品是否受到污染进行检测，对发生污染的要及时进行灭活处理。在生产过程中必须严格按照操作流程预防支原体污染的发展，促进兽用疫苗的良性生产与应用。