脑络通颗粒对脑缺血再灌注损伤大鼠凋亡及PRMT5、p53 的影响*

马莉，董园振，李良勇

1 安徽中医药大学中西医结合学院 安徽合肥 230011

2 上海中医药大学附属曙光医院安徽医院 安徽合肥 230000

3 安徽中医药大学第一附属医院 安徽合肥 230031

脑梗死是由于各种原因导致脑血流供应障碍，引发脑组织缺血、缺氧，从而形成的一系列神经功能缺损的临床综合征[1]。急性脑梗死早期注重静脉溶栓及血管内治疗[2]，能在脑血流阻断后快速恢复脑组织血液供应，在脑组织血流重新恢复的同时，再灌注的血流同样也会造成血脑屏障的破坏、加重脑细胞的凋亡，出现脑出血、脑水肿等并发症[3]，此现象称为脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI）。研究表明，脑络通颗粒对脑梗死有显著的疗效，可明显改善患者的神经功能和侧枝循环等，但对脑缺血再灌注损伤目前尚无相应的研究[4]。细胞凋亡参与了脑缺血再灌注损伤的发生发展的过程，是其重要的发病机制，及时阻止神经细胞凋亡程序的启动能够有效的保护神经功能[5]。本研究旨在探讨脑络通颗粒对大鼠脑缺血再灌注损伤及其神经细胞凋亡是否有神经保护作用，并进一步发掘其作用机制，同时为中医药在临床中治疗脑缺血再灌注损伤提供更多的实验依据。

材料与方法

1 实验动物

健康成年SPF 级雄性SD 大鼠36 只，体重250 ～280 g。采用随机数字表法将所有大鼠分成假手术组（Sham）、模型组（MCAO/R）和脑络通组（NLT）。在室温20 ～ 25℃和相对湿度50 ～ 60%的环境下饲养大鼠，饲养笼保持清洁，实验动物于造模前适应性饲养7 天。本研究获得安徽中医药大学实验动物伦理委员会审核批准。

2 主要药物与试剂

脑络通颗粒（黄芪 20g，当归 10g，赤芍 10g，川芎6g，葛根 15g，石菖蒲 10g，地龙 10g，熟地黄 6g），所有药物由安徽中医药大学第一附属医院中药房提供。Caspase-3（批号：9661T，CST），p53（批号：60283-2-IG，proteintech），PRMT5（批号：79998S，CST），Bcl-2（批号：AF6139，Affinity），β-actin（批号：WL01372，购自沈阳万类生物科技有限公司），TUNEL 试剂盒（货号：G002-1-2，购自南京建成生物科技有限公司），TTC 染色试剂（货号：G3005，索莱宝）。

3 主要仪器

实验方法台式高速冷冻离心机（H1650R，上海卢湘仪），台式低速离心机（TDZ6B-WS，上海卢湘仪），电动玻璃匀浆机（DY89-Ⅱ，宁波新芝生物科技股份有限公司），微量加样器（Bio-DL），酶标仪（SPECTRA max Plus 384，Molecular Devices 公司），电泳系统（Mini-Proten Tetra System，Bio-RAD 公司），凝胶成像仪（ChemiDoc XRS+ System，Bio-RAD 公司），倒置荧光显微镜（Nikon Eclipse Ti-SR，日本尼康）。

4 动物造模与给药

采用大鼠脑缺血再灌注损伤模型（Middle Cerebral Artery Occlusion / Reperfusion， MCAO/R）制备方法[6]，各组大鼠麻醉满意后，右侧颈前区脱毛、消毒，逐层钝性分离颈前区皮肤和肌肉组织，充分暴露大鼠右侧颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉，结扎颈总动脉及颈外动脉近心端，在颈总动脉与颈内动脉分叉处剪一切口，经切口将备好的线栓沿颈内动脉送至大脑中动脉起始部，阻断血流。缺血2 h 后缓慢拔出线栓，再灌注22 h。假手术组只暴露右侧颈总动脉，而不进行其余操作。造模后，脑络通组给予脑络通颗粒灌胃，按20.2 g/（kg·d）灌服，每天1 次，持续7 天。假手术组和模型组按同样的方法同时灌胃同体积生理盐水。

5 神经功能缺损评分（Zea Longa）

每组随机挑选6 只大鼠，选一位不熟悉分组情况的工作人员，参照Zea Longa 评分标准[7]对再灌注22h 后大鼠进行神经功能评分，总分0 ～5 分。Zea Longa 评分标准：0 分代表无神经缺损症状，完全正常；1 分代表不能完全伸展左侧前肢，轻度障碍；2 分代表行走时向偏瘫侧转圈，中度障碍；3 分代表行走时向偏瘫侧倾倒，重度障碍；4 分代表不能自发行走、意识障碍；5 分代表死亡。评分越高，说明神经功能缺损程度越严重。保留评分1 ～3 分建模后大鼠，模型在实验中随机补全，以确保实验中每组大鼠数量不变。

6 TTC 染色法

连续用药7 天后，在深度麻醉后取各组大鼠脑组织，新鲜脑组织用0.9%氯化钠溶液冲洗后放入-20℃冰箱中冷冻15 分钟，将冷冻后脑组织沿冠状面切成2mm 厚度切片，用2%的TTC 染液在黑暗环境下放入37℃的恒温箱中孵育染色15 分钟（红色为正常脑组织，白色为梗死脑组织），拍照后用Image J 软件计算大鼠梗死脑组织百分比。

7 TUNEL 染色

取各组大鼠脑组织分别进行脱水、浸蜡、包埋、切片，切片厚度约3 ～5µm，将上述切片置于60℃烤箱内烤片后保存。加入TUNEL 染色液，避光孵育1 小时，PBS 漂洗，中性树胶封片，用光学显微镜下随机选取5个缺血脑组织视野进行观察，记录阳性染色（绿色）细胞数，并计算细胞凋亡率情况。

8 Western blot 检测PRMT5、P53、Bcl-2、Caspase-3

将各组大鼠脑组织进行取材，RIPA 细胞裂解液裂解，离心、取上清、提取总蛋白，然后凝胶电泳、转膜、5% 脱脂奶粉封闭2 h。加入PRMT5、P53、Bcl-2、Caspase-3 蛋白Ⅰ抗（1:1000）及 β-actinI 抗（1:500），经过一夜4℃孵育后再用TBST 漂洗，而后加入HRP 标记的二抗（1:10000），最后加入ECL 显色、曝光。最后用Image J 软件对各指标进行分析。

9 统计学分析

采用SPSS 21.0 进行统计学分析，数据用平均值±标准差表示，组间比较用单因素方差分析，P＜ 0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 各组大鼠神经功能评分和脑梗死体积的变化

与假手术组比较，模型组大鼠神经功能评分及脑梗死体积显著增加（P＜ 0.05）；与模型组比较，脑络通颗粒组大鼠神经功能评分及脑梗死体积显著降低（P＜0.05），见图1。

图1 各组大鼠的神经功能评分和脑梗死体积

2 各组大鼠神经细胞凋亡的变化

与假手术组比较，模型组大鼠神经元细胞凋亡率显著增加（P＜ 0.05）；与模型组比较，脑络通颗粒组大鼠神经元细胞率显著下降（P＜ 0.05），见图2。

图2 各组大鼠神经细胞凋亡的变化

3 各组大鼠脑组织Bcl-2、Caspase-3 蛋白的变化

与假手术组比较，模型组大鼠脑组织Caspase-3蛋白表达水平显著增加、Bcl-2 蛋白表达水平显著降低（P＜ 0.05）；与模型组比较，脑络通颗粒组大鼠脑组织Caspase-3 蛋白表达水平显著降低、Bcl-2 蛋白表达水平显著上调（P＜ 0.05），见图3。

图3 各组大鼠脑组织Bcl-2、Caspase-3 蛋白的变化

4 各组大鼠脑组织p53蛋白的变化

与假手术组比较，模型组大鼠脑组织p53表达水平显著增加（P＜ 0.05）；与模型组比较，脑络通颗粒组大鼠脑组织p53 表达水平显著下调（P ＜ 0.05），见图4。

图4 各组大鼠脑组织p53 蛋白的变化

5 各组大鼠脑组织PRMT5 蛋白的变化

与假手术组比较，模型组大鼠脑组织PRMT5 表达水平显著增加（P ＜ 0.05）；与模型组相比，脑络通颗粒组大鼠脑组织PRMT5 表达水平显著下调（P ＜0.05），见图5。

图5 各组大鼠脑组织PRMT5 蛋白的变化

讨 论

随着现代人饮食习惯及生活方式的改变，我国脑血管病的发生率不断升高，其中，缺血性脑血管病约占发病总数70%～80%[8]，成为危害国人生活质量和生命健康的主要疾病之一。当缺血性脑血管病发生后，治疗的首要目标是恢复脑组织血液供应，防止脑组织因缺血、缺氧导致神经功能进一步加重。然而，部分患者在脑组织血流恢复后出现症状加重的现象，即脑缺血再灌注损伤[9]。祖国医学认为脑缺血再灌注损伤属于“中风病”的范畴，且本病正虚为本，邪实为标。其主要机制为气虚血瘀、脉络不通。故在治疗上以益气活血为重要法则[10]。脑络通颗粒是我院在临床中治疗脑血管病当中不断积累总结而成，主要由黄芪、当归 、赤芍、川芎、葛根、石菖蒲、地龙、熟地黄等药物组成，参考补阳还五汤重在补气、辅以活血化瘀通络的立方思想，故本方重用黄芪为君，气旺则血行，以兼具补血与活血的当归为臣，助君补气活血的同时，祛瘀而不伤血，佐以赤芍、川芎、熟地黄活血行气，地龙、葛根化瘀通络，配以石菖蒲醒神，诸药合用，共达补气活血、通络开窍等作用[11]。因此，我们将脑络通颗粒应用于CIRI 大鼠，研究发现，脑络通颗粒可改善大鼠的神经功能缺损症状，可减小CIRI 大鼠的脑梗死体积。

凋亡是由基因调控，细胞自主、有序的主动死亡。凋亡由多种基因调控，主要包含Bcl-2家族、Caspase家族等。Bcl-2 作为一种重要的抑制细胞凋亡的蛋白，与脑血缺再灌注损伤后神经功能呈负相关，表达水平越高说明抑制神经细胞凋亡能力越强，是一种重要的内源性神经保护物质[12]。而Caspase-3 是Caspase 家族中最具代表性的蛋白酶，是一种凋亡执行蛋白酶，激活后会通过影响DNA 的代谢和修复导致DNA 裂解及mRNA 衰变，从而引发细胞凋亡[13]。经现代药理学研究，方中黄芪主要成分为黄芪甲苷及黄芪多糖，Yang 等[14]研究发现黄芪甲苷可使促细胞凋亡蛋白Caspase-3 水平下调，抑制神经细胞凋亡，保护神经功能。当归中有效成分主要是当归多糖，在当归多糖干预心肌缺血再灌注损伤大鼠的研究中，叶建华等[15]发现其可能促进抑制细胞凋亡因子Bcl-2 的表达，达到抗凋亡的作用。石菖蒲中有效成分主要包括挥发油、黄酮类化合物、多糖等，可以促进Bcl-2 的表达，从而阻止海马神经元的凋亡。本研究发现，脑络通颗粒可上调CIRI 大鼠脑组织Bcl-2 蛋白表达水平，下调Caspase-3 蛋白的表达水平，并抑制CIRI 大鼠神经细胞凋亡，从而对脑缺血再灌注损伤大鼠起到神经保护作用。

肿瘤抑制基因p53 作为促细胞凋亡基因，被激活的p53 主要通过调控细胞周期、抑制细胞增殖发挥诱导细胞凋亡的作用[16]。相关研究表明，p53 表达水平与脑缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡呈正相关[17]，激活p53 能使促细胞凋亡蛋白Caspase-3 表达水平上调，抑制p53 有利于抗细胞凋亡蛋白Bcl-2 的表达[18]。Wu 等将黄芪应用于细菌内毒素脂多糖（LPS）干预的人肺II 型上皮肺腺癌细胞系、人脐静脉内皮细胞系和人膀胱癌细胞系，研究发现黄芪可抑制p53 通路，上调Bcl-2 蛋白表达，降低Caspase-3 表达水平，发挥抗细胞凋亡作用[19]。此外，研究表明川芎可通过抑制p38 MAPK/p53 信号传导，抑制肾小管上皮细胞凋亡，改善急性肾损伤和肾纤维化[20]。同样，本研究表明，脑络通颗粒可抑制CIRI 大鼠脑组织p53 的表达，从而上调CIRI 大鼠脑组织Bcl-2 蛋白表达水平，下调Caspase-3 蛋白的表达，进而抑制CIRI 大鼠神经细胞凋亡。

蛋白精氨酸甲基转移酶家族（protein arginine methyltransferases， PRMTs）催化蛋白精氨酸甲基化修饰，影响蛋白质-蛋白质和蛋白质-核酸之间的相互作用，参与调节细胞凋亡的基础过程[21]。PRMT5作为PRMT 家族主要成员之一，研究发现，在CIRI 脑组织中PRMT5 表达水平明显升高，抑制PRMT5 可改善CIRI 小鼠的神经功能、减轻小鼠脑梗死体积[22]。本研究同样发现，在CIRI 大鼠脑组织中PRMT5表达水平较假手术组明显升高，且脑络通颗粒可显著降低CIRI 大鼠脑组织PRMT5 的表达水平。

综上，本研究结果显示，脑络通颗粒可显著改善CIRI 大鼠的神经功能缺损症状，减小CIRI 大鼠的脑梗死体积；脑络通颗粒可能是通过抑制PRMT5、p53基因表达，下调Caspase-3 蛋白和上调Bcl-2 蛋白表达水平抑制神经细胞凋亡，从而对脑缺血再灌注损伤大鼠起到神经保护作用。