马齿苋中总酚提取工艺研究

曹利慧，肖梓莹，曹作佳，李胜杰，高 兢

（衡水学院应用化学系，河北衡水 053000）

马齿苋是马齿苋科一年生草本植物，药食兼用，具有抗菌作用，在我国民间常被用来治疗因肠道细菌所引起的肠炎腹泻，被人们称为“天然抗生素”[1]。研究发现，马齿苋中富含多酚、多糖、生物碱和黄酮等生物活性物质[2-3]，其中的多酚物质具有抗氧化[4]、抑菌[5]、抗衰老[6]、抗炎[7]、抗肿瘤[8]等药理作用，尤其在抗氧化和抗菌抗炎方面有更好的效果。因此，马齿苋多酚在食品工业、医药加工和化妆行业都具有良好的发展前景和重要的应用价值[9]。而多酚提取率是影响其应用发展的瓶颈，因此，选择优良的提取方式，提高马齿苋多酚的提取率具有重要意义。本文采用超声波辅助提取马齿苋多酚，研究影响提取效果的因素，通过单因素实验和响应面实验相结合，得到马齿苋多酚的最佳提取工艺条件。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

马齿苋，采自衡水市市郊，去残根杂质，洗净，自然阴干后置于65℃烘箱中烘干。取出，用高速万能粉碎机粉碎，过60目筛成干粉，备用。

没食子酸；福林酚；无水碳酸钠；无水乙醇。

722G 可见分光光度计，上海仪点分析仪器有限公司；TD4台式低速离心机，湖南赫西仪器装备有限公司；高速万能粉碎机，天津泰斯特仪器有限公司；BL6-180A超声波清洗机，上海比朗仪器有限公司；RE-52C旋转蒸发仪，巩义市予华仪器有限责任公司。

1.2 总酚含量的测定

1.2.1 标准曲线的绘制

称取0.010 0 g 没食子酸，加入95%乙醇，定容至100 mL 容量瓶，得到浓度为0.1 mg/mL 的没食子酸标准溶液。准确移取0～1.00 mL 标准溶液，其间间隔0.20 mL，用95%乙醇定容至1.00 mL。混合均匀，加福林酚原液0.70 mL、蒸馏水5.00 mL，摇匀，静置反应3 min。然后加碳酸钠溶液3.00 mL 和蒸馏水0.30 mL，混匀避光50 min。将溶液置于分光光度计中于760 nm波长处测其吸光值。为了减小误差，进行三次平行试验。

1.2.2 马齿苋总酚含量的测定

取样品提取液稀释合适倍数后，采用福林酚比色法测定多酚含量。多酚含量计算公式：

式中：n 为稀释倍数；C 为马齿苋总酚质量浓度，mg/mL；V 为提取液的体积，mL；m 为马齿苋粉末质量，g。

1.3 总酚提取的单因素实验

1.3.1 超声时间对马齿苋多酚提取率的影响

用电子天平称取1.000 g 马齿苋粉末，取浓度为20%的乙醇，依据料液比1∶20（g/mL）、提取温度60℃，设置超声时间在80 min、90 min、100 min、110 min、120 min下提取，测总酚的含量。

1.3.2 乙醇浓度对马齿苋多酚提取率的影响

用电子天平称取1.000 g 马齿苋粉末，在料液比1∶20（g/mL）、提取温度为60℃、超声时间为110 min 条件下，按不同乙醇浓度（10%、20%、30%、40%、50%）提取，测总酚含量。

1.3.3 温度对马齿苋多酚提取率的影响

用电子天平称取1.000 g 马齿苋粉末，按料液比1∶20（g/mL）混合，乙醇浓度为30%，设定超声时间110 min，测定清液多酚含量，研究温度30℃、40℃、50℃、60℃、70℃对多酚提取率的影响。

1.3.4 料液比对马齿苋多酚提取率的影响

用电子天平称取1.000 g 马齿苋粉末，控制超声时间110 min、提取温度为60℃，在乙醇浓度为30%的情况下，以料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30（g/mL）分别进行总酚提取，进行总酚含量的测定。

1.4 响应面实验

以单因素实验为基础进行优化，探究提取马齿苋总酚的最佳提取条件。以超声时间、乙醇浓度、提取温度和料液比4因素3水平组合得到29组试验，通过计算多酚提取率得到提取马齿苋总酚的最优条件（表1）。

表1 设计试验因素与水平表

2 结果与讨论

2.1 标准曲线的绘制

以没食子酸为对照品，得出标准方程：y = 0.010 34x + 0.033 1，R2为0.998 5，标准曲线如图1。

图1 没食子酸标准曲线

2.2 单因素实验

2.2.1 超声时间对多酚提取率的影响

超声时间对多酚提取率的影响见图2。从图2 可看出，在超声时间90～110 min 范围内提取率随时间的增加而变大，多酚提取率平均值最高为超声时间110 min 时，平均提取率为81.7%，此时马齿苋中多酚已提取完全。再延长时间，提取率下降。可能是多酚与空气中的氧发生了反应，导致提取率下降。因此，初步确定110 min 的超声时间是马齿苋多酚最佳提取条件。

图2 超声时间对多酚提取率的影响

2.2.2 乙醇浓度对多酚提取率的影响

乙醇浓度对多酚提取率的影响见图3。由图3 可得，当乙醇浓度增加，提取率先变大，后变小，再变大，这是由于水溶性总酚主要在细胞的大液泡中分散，而不溶于水的总酚附着在细胞壁上，能与蛋白质或多糖结合形成氢键。低浓度的溶剂会进入细胞，而高浓度的溶剂会使蛋白发生变性，从而阻碍总酚的传递，降低提取率。考虑到节省溶剂，初步确定30%的乙醇浓度是马齿苋多酚最佳提取条件。

图3 乙醇浓度对多酚提取率的影响

2.2.3 提取温度对多酚提取率的影响

提取温度对多酚提取率的影响关系见图4。由图4可得，在30℃～50℃时，提取温度对总酚提取率基本没有明显影响，可能因为没有达到多酚物质扩散的最低温度；当温度在60℃时，提取率最大，可能因温度上升对多酚的扩散、溶出更有利；再提升温度，提取率明显下降。可能因温度太高，破坏了多酚，因此，可认为60℃是马齿苋中总酚提取的最佳条件。

图4 提取温度对多酚提取率的影响

2.2.4 料液比对多酚提取率的影响

料液比对多酚提取率的影响见图5，由图5 可知，料液比对多酚提取率影响整体是先增后减，在1∶25（g/mL）之前，提取率随料液比增大而增大，而在1∶25（g/mL）时，提取率达到最大；再加大料液比，平均提取率下降，表明这时多酚物质已不再溶出。因此，初步确定料液比为1∶25（g/mL）为最佳。

图5 料液比对多酚提取率的影响

2.2.5 响应面试验设计及结果

使用Design Expert 8.0.6 进行数据分析，其响应面试验设计及结果如表2。

表2 响应面试验设计及响应结果

将数据拟合，获得多酚提取率（Y）与提取时间（A）、提取温度（B）、乙醇浓度（C）、液料比（D）之间关系的二元多项回归方程：

Y=129.60+4.08A+1.17B+1.08C+9.00D-0.750 0AB-3.00AC-1.000 0AD+3.25BC+4.50BD-0.508A2-10.38B2-9.01C2-5.63D2（见表3）

表3 回归模型各项方差分析

由表3 可知，F=2.50，说明该模型显著，只有4.87%的概率会出现这么大的F 值，P＜0.050 0，说明该模型项显著。表3中P=0.182 3且P ＞0.05，说明失拟检验不显著，该回归模型具有可行性。根据表3 可知，C、AD、B2是重要的模型项，多酚得率显著（p＜0.05）。拟合不足F=2.63，相对于纯误差而言并不显著。由回归模型各项方差分析可知，马齿苋总酚提取影响程度为：乙醇浓度＞超声时间＞料液比＞提取温度。

2.2.6 双因素的交互作用对总酚提取率的影响

双因素的交互结果如图6 所示，由图6 可知，图（1）（2）（3）（5）变化曲面均陡峭，说明其对马齿苋多酚提取率有显著影响。而图（4）（6）的变化曲面较缓，表明其对马齿苋多酚提取率的影响弱一些。通过模型的拟合分析，预测的最佳提取条件：超声时间114 min，乙醇浓度34%，提取温度66℃，料液比为1∶28（g/mL）时，多酚得率最高，为44.02%。进行三次平行试验验证，得到平均提取率为43.85%，与预测值44.02%相差较小，说明马齿苋总酚提取条件可行、合理。

图6 两因素交互作用响应面图

3 结论

超声波辅助提取马齿苋多酚与传统水浴浸提法相比，可以缩短提取时间，提高提取效率。本实验采用超声波法提取马齿苋总酚，先进行单因素实验，考查了超声时间、乙醇浓度、提取温度、料液比四个单因素对总酚提取率的影响；在单因素实验基础上再进行响应面实验，分析得出结论：影响马齿苋多酚提取的因素主次顺序：乙醇浓度＞超声时间＞料液比＞提取温度。当超声时间为114 min，乙醇浓度为34%，提取温度为66℃，料液比为1∶28（g/mL）时，多酚得率最高，为44.02%。