钩藤降压解郁方抑制TLR4/NF-кB 信号通路对高血压并发抑郁症大鼠海马小胶质细胞极化的影响

马丹凤，张传香，陈蕾，沈程，赵红霞，任卫琼（.湖南省儿童医院，湖南长沙 40007；.湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙 40007）

高血压是常见的心血管疾病，由于对患者生理、心理等多方面因素的影响，高血压患者患抑郁症的几率超过25%[1]。高血压易诱发抑郁，而不良情绪又易导致血压波动增大，难以平稳控制，且抑郁倾向也导致疾病死亡风险增加[2-3]。高血压并发抑郁症（Hypertension complicated with depression，HD）的发病机制尚未完全阐明。研究[4]发现，高血压患者体内多种炎性细胞因子表达异常，如肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）表达上调等。而外周炎性因子刺激可激活中枢神经炎症，产生活动减少、快感缺失等抑郁样行为[5]。有研究[6]表明，炎性因子损伤血脑屏障导致血液中的毒性物质更容易进入中枢，损伤神经元而引起抑郁症状的出现。小胶质细胞是中枢神经系统中响应免疫应答速度最快的细胞，其极化后可双向调节神经系统炎症反应[7-9]，通过抑制Toll 样受体4（TLR4）来诱导小胶质细胞向M2型极化，可改善中枢神经元损伤[10]。

钩藤降压解郁方以《中医内科杂病证治新义》（胡光慈编著）中的天麻钩藤饮为基础方化裁而来，由钩藤、天麻、地龙、葛根、丹参、川芎、杜仲、桑寄生、白芍、贯叶连翘10 味中药组成。方中以钩藤、天麻熄风平肝为君，地龙活血通络为臣，佐以杜仲、桑寄生清肝疏郁，葛根、白芍滋阴生津，全方具有养阴平肝、化瘀解郁的功效，兼有降压与抗抑郁双重作用。课题组前期研究[11-12]发现，钩藤降压解郁方能通过减少海马组织炎性因子分泌，稳定单胺类神经递质表达，缓解海马神经元损伤，实现对HD 大鼠血压及抑郁样行为的改善作用。因此，本研究拟继续以HD 大鼠为研究对象，探究钩藤降压解郁方对TLR4/核因子кB（NF-кB）信号通路以及小胶质细胞极化状态的影响，以期为其治疗HD 提供科学实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物 8 周龄雄性原发性高血压大鼠（SHR）40 只，SD 雄性大鼠8 只，SPF 级，体质量150～170 g，购于北京维通利华实验动物技术公司，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2021-0006，动物质量合格证号：1100112111113502636。动物饲养于湖南中医药大学第一附属医院医学创新中心实验动物房，实验动物使用许可证号：SYXK（湘）2020- 0003。本实验方案通过湖南中医药大学第一附属医院动物伦理委员会审查，批文号：ZYFY20211110。

1.2 药物及试剂 钩藤降压解郁方10 味中药材均由湖南中医药大学第一附属医院提供。将846 g 全方药材加蒸馏水常规煎煮2次，合并过滤药液，恒温水浴锅蒸发浓缩至生药2.961 g·mL-1高浓度药液，使用时以纯水稀释为1.481、0.740 g·mL-1中、低浓度药液。

苯磺酸左旋氨氯地平片（批号：210903），吉林施慧达药业；盐酸氟西汀胶囊（批号：9492AA），苏州礼来制药公司。阳性药制备：将苯磺酸左旋氨氯地平片（5 mg）与盐酸氟西汀胶囊（20 mg）共同溶解于111.11 mL 蒸馏水中，充分摇匀，制备成含左旋氨氯地平0.045 mg·mL-1+氟西汀0.18 mg·mL-1的混悬液。

TNF-α、IL-1β、IL-10 ELISA 试剂盒（批号：2112R3108、2112R3518、2112R3703），江苏菲亚生物科技公司；TLR4 抗体（批号：20220216），长沙艾方生物科技公司；NF-κB p65抗体（批号：1132BP51），武汉博士德生物公司；CD16、CD206 抗体（批号：00093405、10020244），武汉三鹰生物技术公司；HE染色液（批号：C210904），珠海贝索生物技术公司；尼氏染色液（批号：DK0021），北京雷根生物技术公司。

1.3 主要仪器 BP-98A 型智能无创血压计，北京软隆生物技术公司；YLS-9A 型生理、药理电子刺激仪，济南益延科技发展公司；MIR-262 型恒温箱，日本三洋公司；BX51 型荧光显微镜，日本奥林巴斯公司；TS-1 型摇床，江苏海门其林贝尔仪器公司；H1850 型台式冷冻离心机、TG16W 型微量高速离心机，湖南湘仪实验室仪器公司；352 型酶标仪，芬兰Labsystems 公司；DYY-6C 型电泳仪、DYCZ-24DN型电泳槽、DYCZ-40D型转膜仪，北京六一生物科技公司；PHS-3C 型pH 计，上海仪电科学仪器公司；JJ224BC 型电子天平，美国双杰测试仪器厂；ChemiScope6100-化学发光成像系统，上海勤翔科学仪器公司。

1.4 分组、模型复制及给药 将40 只收缩压稳定在180～200 mm Hg（1 mm Hg＝0.133 kPa）的SHR 大鼠随机分为5组：模型组、阳性药（左旋氨氯地平+氟西汀）组及中药（钩藤降压解郁方）高、中、低剂量组，每组8 只；另取8 只SD 大鼠作为对照组。除对照组外，其他各组大鼠给予慢性应激（CUMS）结合孤养的方式复制HD模型[12]，连续42 d。造模同时给药干预，中药高、中、低剂量组分别给予钩藤降压解郁方29.61、14.81、7.40 g·kg-1灌胃给药，相当于临床用量的3、1.5、0.75 倍；阳性药组给予左旋氨氯地平0.45 mg·kg-1+氟西汀1.8 mg·kg-1灌胃给药；对照组、模型组均给予同等体积的生理盐水灌胃；灌胃体积10 mL·kg-1，每天1次，连续42 d。

1.5 尾动脉收缩压测定 采用无创伤式大鼠尾套加压阻断法于给药前及每周最末日上午测量大鼠尾动脉收缩压，取连续3次测量的平均值作为当周收缩压。

1.6 大鼠行为学检测

1.6.1 糖水偏好实验 造模开始后的第2 周和最后1 周各进行1 次糖水偏好行为学检测[12]。适应性训练48 h，前24 h 给予1%蔗糖水与纯水，后24 h 交换糖水与纯水的位置。实验开始后，各组大鼠禁食禁水23 h，然后分别记录1 h 内各组大鼠的糖水、纯水消耗量；计算：糖水偏好率（%）=糖水消耗量/总消耗量×100%。

1.6.2 水迷宫实验 于造模结束后进行水迷宫实验[13]。前4 d 为适应性训练，引导大鼠学习寻找水中平台，记录所用时间作为逃避潜伏期；第5 天进行空间探索，通过摄像记录大鼠90 s 内穿越平台次数，计算目标象限停留时间占比。

1.7 ELISA 法测定血清炎性因子TNF-ɑ、IL-1β、IL-10 水平 给药结束后大鼠禁食24 h，然后用3%戊巴比妥钠（1 mL·kg-1）腹腔注射麻醉大鼠；腹主动脉采血，静置、离心后取上清；采用ELISA法检测血清TNF-α、IL-1β、IL-10含量。

1.8 HE 及尼氏染色法观察大鼠海马组织神经元病理变化 每组随机取3 只大鼠解剖、剥离脑组织，经4%多聚甲醛溶液固定、脱水、石蜡包埋、切片后，分别进行HE、尼氏染色，观察海马CA1 区神经元细胞形态变化及尼氏体凋亡情况。

1.9 免疫荧光双染法检测海马组织小胶质细胞CD16、CD206 表达 取小鼠海马组织切片，常规脱蜡、脱水后，以EDTA 抗原修复液进行抗原修复，用山羊血清封闭液在37 ℃下封闭30 min；滴加CD16（1∶300）与CD206（1∶20 000）混合一抗，4 ℃下孵育过夜；复温30 min 后，滴加DyLight 488 荧光素标记羊抗小鼠和荧光DyLight 594 标记羊抗兔IgG 混合二抗（两者稀释比例均为1∶100），室温下孵育45 min；滴加DAPI染色液复染，用抗荧光淬灭封片剂封片；在荧光显微镜下观察、拍照，使用图像分析软件Image Pro Plus 6.0 计算平均荧光强度。通过荧光双染法标记海马小胶质细胞中M1、M2型小胶质细胞的特有标志物CD16、CD206，进行荧光强度分析，计算M2/M1 型小胶质细胞占比。

1.10 Western Blot 法检测海马组织中TLR4、NF-κB p65 蛋白的表达取大鼠海马组织适量，称质量后剪碎，加入含有PMSF 的裂解液中，充分匀浆后冰上孵育20 min；以4 ℃、13 000 r·min-1（离心半径=11 cm）离心20 min，取上清液，采用BCA 法测定总蛋白浓度。上样20 μL蛋白，经SDS-PAGE 凝胶电泳后，将蛋白转至PVDF 膜；5%脱脂奶粉封闭后，滴加一抗TLR4（1∶500）、NF-κB p65（1∶1 000）、GAPDH（1∶5 000），4 ℃下孵育过夜；洗涤后滴加二抗（1∶5 000），室温下孵育90 min；洗涤后采用ECL显影定影，扫描；采用ImageJ 图像分析软件测定各蛋白条带灰度值，以GAPDH 为内参，对目的蛋白进行半定量分析。

1.11 统计学处理方法 采用SPSS 24.0 统计软件进行数据分析；计量资料以均数±标准差（±s）表示；多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用LSD-t检验；水迷宫实验逃避潜伏期数据采用重复测量设计的方差分析；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 钩藤降压解郁方对HD 大鼠尾动脉收缩压的影响结果见图1。与对照组比较，模型组大鼠第1～6周的尾动脉收缩压均显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，给药组大鼠第1～6周的尾动脉收缩压均显著降低（P＜0.01）。结果表明，钩藤降压解郁方可有效降低HD大鼠的尾动脉收缩压。

图1 钩藤降压解郁方对高血压并发抑郁症大鼠尾动脉收缩压的影响（±s，n=8）Figure 1 Effect of Gouteng Jiangya Jieyu Perscription on tailartery blood pressure in hypertension complicated with depression rats（±s，n=8）

2.2 钩藤降压解郁方对HD 大鼠糖水偏好率的影响结果见表1。造模第2 周，各组间大鼠的糖水偏好率无明显差异（P＞0.05）。给药结束后，与对照组比较，模型组大鼠的糖水偏好率显著下降（P＜0.01）；与模型组比较，给药组大鼠的糖水偏好率均明显上升（P＜0.05）。结果表明，钩藤降压解郁方可改善HD大鼠抑郁程度。

表1 钩藤降压解郁方对高血压并发抑郁症大鼠糖水偏好率的影响（±s，n=8）Table 1 Effect of Gouteng Jiangya Jieyu Perscription sucrose preference in hypertension complicated with depression rats（±s，n=8）

表1 钩藤降压解郁方对高血压并发抑郁症大鼠糖水偏好率的影响（±s，n=8）Table 1 Effect of Gouteng Jiangya Jieyu Perscription sucrose preference in hypertension complicated with depression rats（±s，n=8）

注：与对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05

组别对照组模型组阳性药组中药高剂量组中药中剂量组中药低剂量组糖水偏好率/%造模第2周73.08±9.27 71.85±5.59 69.74±6.25 70.51±6.78 72.57±7.30 73.62±3.45给药结束后76.08±18.01 48.76±13.00**63.76±7.24△61.98±6.16△61.86±15.67△56.25±6.65△

2.3 钩藤降压解郁方对HD 大鼠学习记忆能力的影响结果见表2、图2。与对照组比较，模型组大鼠的逃避潜伏期明显延长（P＜0.05，P＜0.01），穿越平台次数及目标象限停留时间占比显著降低（P＜0.01）。与模型组比较，阳性药组及钩藤降压解郁方高剂量组大鼠的逃避潜伏期明显缩短（P＜0.05，P＜0.01），穿越平台次数及目标象限停留时间占比均明显增加（P＜0.05）。结果表明，钩藤降压解郁方能够改善HD大鼠的学习记忆能力。

表2 钩藤降压解郁方对高血压并发抑郁症大鼠逃避潜伏期的影响（±s，n=8）Table 2 Effect of Gouteng Jiangya Jieyu Perscription on escape latency in hypertension complicated with depression rats（±s，n=8）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组别对照组模型组阳性药组中药高剂量组中药中剂量组中药低剂量组逃避潜伏期/s第1天65.09±8.68 64.03±5.42 63.59±6.06 62.44±5.59 61.44±6.71 60.46±12.15第2天51.94±8.86 63.91±3.42*46.84±8.12△△51.03±12.07△51.34±7.02△54.31±14.68第3天29.09±16.78 46.13±6.87**32.94±8.55△34.37±11.11△34.87±12.42 36.84±9.64第4天16.84±5.77 32.56±14.03**17.13±5.62△△21.53±5.95△24.78±9.27 26.94±8.32

2.4 钩藤降压解郁方对HD 大鼠血清炎症因子水平的影响 结果见表3。与对照组比较，模型组大鼠的血清TNF-α、IL-1β 含量显著上升（P＜0.01），IL-10 含量显著下降（P＜0.01）。与模型组比较，给药组大鼠的血清TNF-α、IL-1β 含量显著下降（P＜0.01），IL-10含量显著上升（P＜0.01）。结果表明，钩藤降压解郁方能够抑制HD 大鼠的血清促炎因子TNF-α、IL-1β水平，提高抗炎因子IL-10水平。

表3 钩藤降压解郁方对高血压并发抑郁症大鼠血清炎症因子水平的影响（±s，n=8）Table 3 Effects of Gouteng Jiangya Jieyu Perscription on serum inflammatory cytokines in hypertension complicated with depression rats（±s，n=8）

表3 钩藤降压解郁方对高血压并发抑郁症大鼠血清炎症因子水平的影响（±s，n=8）Table 3 Effects of Gouteng Jiangya Jieyu Perscription on serum inflammatory cytokines in hypertension complicated with depression rats（±s，n=8）

注：与对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01

组别对照组模型组阳性药组中药高剂量组中药中剂量组中药低剂量组TNF-α/（pg·mL-1）158.78±14.14 475.80±23.11**184.57±15.62△△201.06±23.32△△209.74±29.87△△271.40±20.18△△IL-1β/（pg·mL-1）185.04±19.65 543.11±31.61**249.53±10.87△△258.42±19.79△△297.11±40.31△△383.33±53.20△△IL-10/（pg·mL-1）52.30±2.69 20.64±1.36**50.39±2.45△△48.05±2.29△△46.59±2.44△△39.64±3.04△△

2.5 钩藤降压解郁方对HD 大鼠海马组织病理变化的影响 结果见图3。HE 染色结果显示，对照组大鼠海马CA1 区神经元结构完整，轴突布满整个视野，胞体整齐排列，核质分明。与对照组比较，模型组胞核深染，胞质固缩，细胞凋亡明显。与模型组比较，阳性药组及中药高剂量组的神经元椎体细胞结构相对完整，细胞凋亡明显减少。尼氏染色结果显示，对照组大鼠海马CA1 区神经元细胞核仁清晰，胞体与树突基部尼氏体丰富。与对照组比较，模型组视野中多空泡状胞体，胞内尼氏体大量溶解，泛白色。与模型组比较，阳性药组及中药高、中剂量组细胞内尼氏体丰富，空泡状细胞较少。结果表明，钩藤降压解郁方能够减轻HD大鼠海马神经元损伤。

图3 钩藤降压解郁方对高血压并发抑郁症大鼠海马CA1 区病理变化的影响Figure 3 Effect of Gouteng Jiangya Jieyu Perscription on hippocampus CA1 region in hypertension complicated with depression rats

2.6 钩藤降压解郁方对HD 大鼠海马小胶质细胞M1、M2 型活化的影响 结果见图4。与对照组比较，模型组大鼠海马小胶质细胞CD206/CD16 荧光强度比明显降低（P＜0.05）。与模型组比较，阳性药组及中药高剂量组大鼠海马小胶质细胞CD206/CD16 荧光强度比明显升高（P＜0.05，P＜0.01）。结果表明，钩藤降压解郁方高剂量可提高HD 大鼠海马M2 型小胶质细胞占比。

图4 钩藤降压解郁方对高血压并发抑郁症大鼠海马小胶质细胞中CD16、CD206 阳性细胞的影响（免疫荧光，×400；±s，n=3）Figure 4 Effects of Gouteng Jiangya Jieyu Perscription on CD16 and CD206 positive cells in the section of hippocampal microglia in hypertension complicated with depression rats（IF，×400；±s，n=3）

2.7 钩藤降压解郁方对HD 大鼠海马组织TLR4、NF-кB p65 蛋白表达的影响 结果见图5。与对照组比较，模型组大鼠海马组织TLR4、NF-кB p65 蛋白表达显著上调（P＜0.01）。与模型组比较，阳性药组及中药高剂量组大鼠海马组织TLR4、NF-кB p65蛋白表达明显下调（P＜0.05，P＜0.01）。结果表明，钩藤降压解郁方对HD 大鼠海马组织TLR4/NF-кB 通路具有抑制作用。

3 讨论

本课题组前期采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱技术检出钩藤降压解郁方中51种化合物，主要包括异钩藤碱、葛根素、丹参酮ⅡA 等[11]。研究[14]表明，异钩藤碱可通过调节神经炎症因子及神经营养因子发挥抗抑郁作用。在脂多糖诱导的神经胶质细胞炎症中，异钩藤碱能显著下调炎症因子TNF-α及IL-1β 水平，抑制中枢炎症[15]。葛根素具有多种药理活性，其中枢保护作用与抑制TLR4 蛋白表达来降低促炎因子水平相关[16]。在心血管疾病治疗中，葛根素能有效降低原发性高血压大鼠的收缩压、舒张压及心率，其作用机制与血管舒张相关通路有关[17]。丹参酮ⅡA 能通过调节免疫细胞功能来减少炎症介质产生，如提高抑炎因子IL-10 水平，同时抑制促炎因子TNF-α、IL-1β 表达，在心血管及神经系统疾病方面具有保护作用[18]。还有研究[19]表明，葛根素与丹参酮ⅡA 联合可以更好地抑制炎症细胞浸润，减少心肌细胞破坏。本研究结果表明，钩藤降压解郁方可有效降低HD 大鼠的尾动脉收缩压，并改善其抑郁程度及学习记忆能力，抑制血清促炎因子TNF-α、IL-1β 水平，提高抗炎因子IL-10 水平，表现出较强的抗炎活性。

认知障碍被认为是抑郁症的核心特征[20]，HD 患者的记忆能力下降程度比单纯的高血压患者表现得更为严重[21]。海马体是脑内掌管学习记忆功能最重要的区域，海马神经元损伤是认知障碍发生的重要因素。本研究通过水迷宫实验显示，钩藤降压解郁方能够有效改善HD 大鼠的学习记忆能力；结合海马CA1区神经细胞病理学观察发现，钩藤降压解郁方能够减轻HD 大鼠海马神经元损伤，表现出较好的神经细胞保护作用。

小胶质细胞是维持中枢神经系统稳态最重要的免疫细胞，其能迅速识别损伤及感染，由静止转为活化状态[22]。活化的小胶质细胞具有双重性，根据其特性分为M1 与M2 型，两者在特定条件下可相互转化。M1 型小胶质细胞分泌促炎因子，产生神经毒性；而M2型小胶质细胞则可以通过抗炎因子促进炎症消退，维持大脑环境的稳定[23]。有研究[24]发现，通过IL-4诱导小胶质细胞向M2 型转化后能减少神经元的损伤与凋亡。因此，诱导小胶质细胞由M1 型向M2 型转化可促进对中枢神经细胞的保护作用。TLR4 是小胶质细胞表面非特异性免疫模式识别受体，通过激活其下游信号分子NF-κB 诱导小胶质细胞向M1 型活化[25-26]，抑制TLR4/NF-κB 途径能够减轻小胶质细胞产生的中枢神经炎症[27]。通过荧光双染法标记海马小胶质细胞中M1、M2 型小胶质细胞的特有标志物CD16、CD206[28-29]，可以分析M2/M1 型小胶质细胞占比。本研究结果表明，钩藤降压解郁方高剂量可提高HD 大鼠海马M2 型小胶质细胞占比，并能下调海马组织TLR4、NF-кB p65蛋白表达。

综上所述，钩藤降压解郁方可有效降低HD 大鼠的尾动脉收缩压，并改善其抑郁程度及学习记忆能力，减轻海马神经元损伤，可能与其通过抑制TLR4/NF-кB 通路提高M2 型小胶质细胞占比，抑制血清促炎因子TNF-ɑ、IL-1β 水平，提高抗炎因子IL-10 水平有关。