HPLC-MS/MS 法同时测定清开灵口服液中7 种成分的含量

吴锦云，蔡凯伟，陈红英，王家祺，潘碧妍，谢智勇，廖琼峰［. 广州中医药大学中药学院，广东广州 50006；. 广州白云山明兴制药有限公司，广东广州 5050；. 中山大学药学院（深圳），广东深圳 58406］

清开灵口服液处方来源于“温病三宝”中的安宫牛黄丸，是由胆酸、猪去氧胆酸、珍珠母、水牛角、栀子、板蓝根、金银花和黄芩苷制成的中药制剂，具有清热解毒、镇静安神的功效，用于外感风热时毒、火毒内盛所致发热、咽喉肿痛、舌质红绛、苔黄、脉数者。针对当前新冠疫情流行现状，临床上也有将其应用于新型冠状病毒感染的治疗[1]。因此，清开灵口服液具有较高的临床使用价值和良好的经济效益。2020 年版《中国药典》（一部）规定对清开灵口服液中的胆酸、栀子苷和黄芩苷进行含量测定[2]。但对于一个由5 味中药及3 种中药成分组成的制剂，仅测定其中的3种成分，难以全面控制制剂的质量。目前已有报道[3-5]清开灵口服液中一种或多种成分的含量测定方法。同时清开灵其他剂型的含量测定亦有较多报道[6-9]。但其中应用高效液相色谱（HPLC）法测定的时间较长，应用高效液相色谱-质谱联用（HPLC - MS/MS）法则未对板蓝根中的有效成分进行含量测定。相关文献表明，清开灵口服液中的猪去氧胆酸[10-11]、板蓝根成分腺苷[12-13]、金银花成分绿原酸和咖啡酸[14-15]均具有抗炎、抗病毒等药理活性。因此，本研究基于成分有效性及可测性原则，根据清开灵口服液的处方组成，选择了《中国药典》中规定的3 种成分胆酸、栀子苷、黄芩苷，同时增加了猪去氧胆酸、绿原酸、咖啡酸和腺苷4 种成分，采用HPLC-MS/MS 技术建立清开灵口服液的含量测定方法，以期为其质量控制提供参考。

1 仪器和材料

1.1 仪器 Agilent 1260 高效液相色谱-6460 三重四级杆质谱联用仪（美国Agilent Technologies 公司）；Vortex Mixer XW-80A 型涡旋振荡器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；KQ-250B 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；AS62.R2型十万分之一电子天平（波兰RADWAG 公司）；JA/YP 型万分之一电子天平（瑞士METTLER TOLEDO 有限公司）。

1.2 药物和试剂 16 批清开灵口服液（广州白云山明兴制药有限公司，批号分别为1221020、1230510、1230511、1230515、1230602、1230603、1230604、1230606、1230608、1230609、1230610、1230611、1230612、1230613、1230614、12300615）。腺苷、绿原酸、栀子苷、黄芩苷、猪去氧胆酸和胆酸（含量均≥98.0%，中国食品药品检定研究所，批号分别为110879-202204、110753-202119、110749-201919、110715-202223、100087-201411 和100078-201808）；咖啡酸（含量≥98.0%，上海源叶生物科技有限公司，批号：M27GB143417）；甲醇（色谱纯，德国默克化学试剂有限公司）；乙酸铵（色谱纯，上海晶纯生化科技股份有限公司）；甲酸（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱和质谱条件

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×10 mm，1.7 μm）；流动相：含10 mmol·L-1乙酸铵和0.1%甲酸的水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脱（0～3.5 min，80%A；3.5～5 min，80%A→10%A；5～12.2 min，10%A）；柱温：30 ℃；流速：0.15 mL·min-1；进样量：5 μL。

2.1.2 质谱条件 离子源采用电喷雾离子源（ESI），正/负离子模式进行扫描，多反应监测模式（MRM）进行分析，干燥气（氮气）温度为300 ℃，干燥气流速为5 L · min-1，雾化气（氮气）压力为45 psi，鞘气（氮气）温度为300 ℃，鞘气流速为11 L·min-1，毛细管电压为3 500 V，喷嘴电压为500 V。7 种化合物的裂解电压及碰撞能量等质谱参数见表1。

表1 清开灵口服液中7 种化合物的质谱测定参数Table 1 The mass spectral parameters of 7 components in Qingkailing Oral Liquid

2.2 溶液的配制

2.2.1 样品溶液的制备 分别精密量取15个批次的清开灵口服液0.25 mL，置于10 mL 的容量瓶中，加入50%甲醇稀释至刻度，摇匀，0.22 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得15个批次供试品溶液。

2.2.2 对照品储备液及混合对照品储备溶液的制备分别取腺苷、绿原酸、咖啡酸、栀子苷、黄芩苷、猪去氧胆酸和胆酸对照品适量，精密称定，分别置于7 个10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配成质量浓度分别为1.004、0.998、0.998、0.996、1.002、1.005 和1.037 mg·mL-1的对照品储备液。分别精密量取各对照品储备液适量，用50%甲醇配成质量浓度分别为4.016、14.97、3.992、24.90、501.0、50.25 和155.5 μg·mL-1的混合对照品储备溶液。

2.3 方法学研究

2.3.1 专属性试验 精密量取“2.2.2”项下的混合对照品储备溶液2 mL，置于10 mL 容量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，0.22 μm 微孔滤膜过滤，得混合对照品溶液。取混合对照品溶液及“2.2.1”项下的样品溶液，按“2.1”项下条件分别进样分析，结果显示，腺苷、绿原酸、咖啡酸、栀子苷、黄芩苷、猪去氧胆酸和胆酸在各自的离子通道内均能出峰，且无干扰，表明该方法的专属性良好。MRM 图谱见图1。

图1 清开灵口服液中7 种成分的MRM 提取离子流图Figure 1 The MRM chromatograms of 7 investigated components in Qingkailing Oral Liquid

2.3.2 线性关系考察 精密量取“2.2.2”项下的混合对照品储备溶液0.25、0.5、1、2、4、6、8 mL，置于10 mL 容量瓶中，加50%甲醇水稀释至刻度，摇匀，0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得系列浓度的混合对照品溶液，按“2.1”项下条件进样分析，记录峰面积。以浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，每个成分取5 个浓度点，腺苷、绿原酸、咖啡酸、栀子苷、黄芩苷、猪去氧胆酸和胆酸的线性范围、回归方程、相关系数（r）见表2。

表2 清开灵口服液中7 种成分的线性范围和回归方程Table 2 Linear ranges，regression equations of 7 components in Qingkailing Oral Liquid

2.3.3 精密度试验 取“2.3.1”项下的混合对照品溶液，按“2.1”项下条件连续进样6 次分析，计算峰面积的RSD。结果显示，腺苷、绿原酸、咖啡酸、栀子苷、黄芩苷、猪去氧胆酸和胆酸峰面积的RSD分别为1.53%、2.48%、0.91%、1.66%、1.65%、2.03%和1.09%，表明该仪器精密度良好。

2.3.4 重复性试验 按照“2.2.1”项下方法平行制备供试品溶液（批号：1221020）6 份，按“2.1”项下条件进样测定，计算峰面积的RSD。结果显示，腺苷、绿原酸、咖啡酸、栀子苷、黄芩苷、猪去氧胆酸和胆酸峰面积的RSD 分别为2.89%、2.14%、1.99%、1.28%、1.73%、1.53%和1.61%，表明该方法重复性良好。

2.3.5 稳定性试验 取同一份供试品溶液（批号：1221020），分别于0、2、4、8、12、24 h 按“2.1”项下条件进行测定，计算峰面积的RSD。结果显示，腺苷、绿原酸、咖啡酸、栀子苷、黄芩苷、猪去氧胆酸和胆酸峰面积的RSD分别为1.81%、2.99%、2.26%、1.06%、3.00%、2.41%和0.62%，表明24 h 内供试品溶液稳定性良好。

2.3.6 回收率试验 精密量取已知含量的清开灵口服液6 份（批号：1221020），每份0.125 mL，分别加入腺苷、绿原酸、咖啡酸、栀子苷、黄芩苷、猪去氧胆酸和胆酸质量浓度分别为5.02、16.69、9.98、37.85、501.00、70.35 和186.66 μg·mL-1的混合对照品溶液1 mL，按“2.2.1”项下方法平行制备供试溶液。按“2.1”项下条件进样分析，并计算回收率。结果显示，腺苷、绿原酸、咖啡酸、栀子苷、黄芩苷、猪去氧胆酸和胆酸的平均回收率分别为100.9%、98.74%、 101.2%、 100.2%、 100.8%、 99.97% 和98.94%，RSD 分别为1.58%、0.59%、1.78%、1.25%、0.65%、1.69%和1.07%。见表3。

表3 清开灵口服液的回收率试验结果（n=6）Table 3 The results of recovery rate of Qingkailing Oral Liquid（n=6）

2.4 样品测定 取15批清开灵口服液样品各3份，分别按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下条件进样分析，使用外标法计算7 种成分的含量。结果见表4。

表4 清开灵口服液中7 种成分的含量测定结果（mg·mL-1，n=3）Table 4 Contents of 7 components in of Qingkailing Oral Liquid（mg·mL-1，n=3）

3 讨论

清开灵口服液处方中含8 味药，成分复杂，采用HPLC-UV 法进行检测时，所需分析时间长，色谱峰干扰较多[6-7]，且处方中黄芩苷和栀子苷属于黄酮类化合物，与有机酸类化合物绿原酸、咖啡酸和核苷类化合物腺苷的最大吸收波长不同，而胆酸、猪去氧胆酸仅有末端吸收，因此用HPLC-UV 法难以满足上述成分的定量测定需求。HPLC-MS/MS 法专属性强，灵敏度高，故选择此方法进行测定。

本实验中考察了不同流动相对色谱峰峰型及响应的影响，使用甲醇作为有机相时，各成分色谱峰响应均优于使用乙腈；在水中分别添加0.1%甲酸、5 mmol·L-1乙酸铵、10 mmol·L-1乙酸铵、0.1%甲酸和10 mmol·L-1乙酸铵进行测定，结果表明，使用0.1%甲酸时，黄芩苷、腺苷色谱峰拖尾严重，使用5 及10 mmol·L-1乙酸铵时，黄芩苷及腺苷的峰型得到改善，而加入0.1%甲酸和10 mmol·L-1乙酸铵后，响应值提高，峰型对称，因此选择甲醇-含10 mmol·L-1乙酸铵和0.1%甲酸的水作为流动相进行梯度洗脱。

2020 年版《中国药典》 规定清开灵口服液“1 mL 含胆酸应为1.50～3.50 mg，1 mL 含栀子苷不得少于0.2 mg，1 mL 含黄芩苷不得少于3.5 mg”。本研究15 批样品中胆酸、栀子苷和黄芩苷的含量测定结果均符合规定。腺苷、绿原酸、咖啡酸和猪去氧胆酸在《中国药典》的清开灵口服液质量标准中无相应限度规定，本研究15批样品含量测定结果表明，腺苷、绿原酸、咖啡酸和猪去氧胆酸各批次之间的含量较为接近，提示这4种成分可以考虑纳入新的质量控制标准中。

综上所述，本研究建立了清开灵口服液中7 种成分的含量测定方法，对其质量进行较为全面的评价。本研究中测定的猪去氧胆酸、绿原酸、咖啡酸、腺苷在清开灵口服液中含量均较为接近，可为清开灵口服液的质量控制和后续研究提供参考。