黔产八角枫HPLC指纹图谱研究*

陈志琳,杜洪志,何 丽,覃春叶,李 玮

(贵州中医药大学,贵州 贵阳 550025)

0 引言

八角枫为八角枫科植物八角枫(Alangiumchinense(Lour.)Harms.)及瓜木(Alangium.platanifolium(Sieb．et Zucc.)Harms.)的干燥细须根(白龙须)或干燥支根(白金条)。具有舒经活络、祛风除湿、散瘀止痛等功效,主要用于治疗四肢麻木、风湿痹痛、跌打损伤等症[1]。现代研究表明,八角枫主要含有生物碱[2-4]、酚苷、木脂素[5-6]、挥发油[7-8]等化学成分,具有肌松及收缩平滑肌[9-11]、抗炎、解热、镇痛[12]等药理作用。由于药材受不同地理环境、土壤微生物、采收时节、加工炮制等综合因素的影响,导致其药材质量参差不齐,因此,建立一种整体、全面的八角枫药材质量控制方法尤为重要[15-16]。本实验采用HPLC以黔产10 个批次的八角枫药材为研究对象,建立了黔产八角枫的 HPLC指纹图谱,为完善八角枫药材质量控制提供依据。

1 仪器与材料

高效液相色谱仪;分析天平; SHA-B数显恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司);沃特浦超纯水机。对照品八角枫碱(批号C102642-210317)质量分数≥98%,购自贵州迪大生物科技有限公司;甲醇、乙酸、乙腈为色谱纯,其余试剂为分析纯。实验用八角枫药材经贵州中医药大学杜洪志老师鉴定为八角枫科植物八角(Alangiumchinense(Lour.)Harms.)的须根,共10 批,产地及采集日期见表1。

表1 八角枫药材信息表

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

取对照品八角枫碱适量,加含5%醋酸的30%甲醇溶液制成2 mg/mL的溶液,即得。

2.2 供试品溶液的制备

取八角枫药材粉末(过3号筛)约2.0 g,置100 mL锥形瓶中,精密加入含5%醋酸的30%甲醇溶液25 mL,摇匀,称定质量,超声提取50 min,放冷,补重,摇匀,滤过,即得。

2.3 色谱条件

色谱柱:HC-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱温:30 ℃;检测波长:259 nm;流速:1.0 mL/min;进样体积 :15 μL。流动相为甲醇-缓冲液(0.2 g庚烷磺酸钠,2.0 g磷酸二氢钾,0.3 mL磷酸,定容至1000 mL),洗脱程序见表2。

表2 梯度洗脱程序

2.4 色谱信息完整性考察

为检查色谱化学信息的完整性,取八角枫(编号S5) 供试品溶液适量,按上述条件进样分析,并将洗脱程序扩展至90 min。色谱图显示,在58 min之后没有出现其他色谱峰,表明采集60 min的HPLC色谱图可以完整地表达八角枫的化学信息,见图1。

图1 样品完整性

图2 10批八角枫药材HPLC指纹图谱叠加图

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验

取八角枫(编号S5) 供试品溶液适量,连续进样6次。对各主要共有峰的相对保留时间和相对峰面积进行统计,结果显示RSD均小于3%,表明仪器的精密度良好。

2.5.2 稳定性试验

取八角枫(编号S5) 供试品溶液适量,在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h进样。记录色谱图,分别计算HPLC图谱中各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD,结果显示RSD均小于3%,表明样品溶液在12 h内基本稳定。

2.5.3 重复性试验

取八角枫(编号S5)供试品溶液适量,连续进样6次。记录色谱图,并计算共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD,结果显示RSD均小于3%,表明重复性良好。

2.6 八角枫药材指纹图谱采集

2.6.1 共有峰和对照图谱的采集

运用中药指纹图谱相似度评价系统2012A版对10批次八角枫的指纹图谱进行相似度分析,指定S7为参照图谱,采用中位数法,自动匹配,多点校正生成对照图谱R,由生成数据的输出结果得到8个共有峰,见图 2。

2.6.2 相似度分析

使用中药色谱指纹图相似度评价系统2012A版进行相似度分析,结果10批次八角枫与对照图谱的相似度在0.801～0.994之间,结果表明收集的黔产八角枫药材整体概貌有一定差异,结果见表3。

表3 黔产八角枫药材指纹图谱相似度

2.7 聚类分析

将生成的8个共有峰峰面积导入SPSS 26.0软件,采用组间连接法进行Q型聚类分析。在类间距为15时,10批次样品聚为3类。其中产自凯里的2批八角枫药材(S7、S8)聚为一类,产自毕节和遵义的2批聚为一类,其余6批聚为一类。

2.8 主成分分析及因子分析

以主成分贡献率及特征值为依据,对8个共有峰峰面积原始数据进行主成分因子分析。特征值和方差贡献率见表4,其值累计为80.110%,表明所分析样品中的大部分化学信息可以通过前三个组分反映出来。根据碎石图(图4)走势可知,前三个成分的曲线陡峭,说明其为引起黔产不同批次八角枫差异性的主要原因。通过正交旋转,得到8个指标在3个主成分中的旋转成分矩阵,见表5。由表5可知,主成分1可以反映所有组分的信息;主成分2可以反映出1、2、5、7、8共5个指标组分的信息;主成分3可以反映出2、3、4、8共4个指标组分的信息。由八角枫药材主成分分析三维图可以看出,10批八角枫药材被分为3大类,结果与聚类分析一致(图3)。载荷图(图5)被用于描述图像的特性,载荷代表的点到原点间的距离被用于衡量载荷的绝对值大小,绝对值越大,表明对主要分量的影响也就越大。10个批次八角枫的主成分综合评分和排序结果见表5,采自遵义地区(S6)的八角枫综合得分最高、品质最佳。

图3 八角枫指纹图谱聚类树状关系

图4 公共因子碎石图

图5 八角枫药材主成分得分图

表4 主成分方差分析

表5 八角枫药材成分矩阵

表6 10批八角枫药材主成分综合得分及排序

综合得分计算公式:

Y=0.39266M1+0.24809M2+0.16035M3

3 讨论

3.1 流动相的选择

比较了乙腈-缓冲液和甲醇-缓冲液不同洗脱梯度对样品的分离情况,结果流动相为甲醇-缓冲液(0.2 g庚烷磺酸钠,2.0 g磷酸二氢钾,0.3 mL磷酸,定容至1000 mL),样品中各峰分离度好。

3.2 检测波长的选择

分别考察229 nm、254 nm、259 nm、262 nm、273 nm共5个检测波长下样品的图谱,发现259 nm下的基线平稳,出峰信息较丰富,而且色谱峰响应值高。

3.3 色谱柱的选择

分别考察了样品在HC-C18柱、Alltech Alltima C18柱、Agilent HP-C18柱、Diamonsil C18柱等不同品牌色谱柱的分离情况,结果显示色谱柱对样品中色谱峰的分离影响不大,色谱条件在上述色谱柱上均能重现。

3.4 供试品样品制备方法的选择

对提取溶剂浓度(30%甲醇、35%甲醇、25%甲醇)、提取方法(超声、回流提取),提取时间(30 min、50 min、70 min)、提取溶剂用量(25 mL 、30 mL、 20 mL)等条件进行筛选,用含 5 %醋酸的30 %甲醇溶液25 mL,超声提取50 min作为供试品溶液的提取方法。

本实验建立了八角枫药材HPLC指纹图谱共有模式,共标示出8个共有峰;不同批次的八角枫药材指纹图谱相似度相对较高(大于0.80),说明黔产各地八角枫的质量相对较稳定。由主成分分析发现,10个批次八角枫的主成分综合评分和排序结果显示,遵义地区(S6)的八角枫综合得分最高。由聚类分析可知黔产各地的八角枫化学成分存在一定差异。