基于网络药理学和分子对接探讨青黛防治2型糖尿病的作用机制研究*

赵友芳,段学清,朱 晨,田维毅

(贵州中医药大学,贵州 贵阳 550025)

0 引言

由于经济水平和生活质量的不断提高,当代人养成了高油、高脂和高糖的饮食习惯,再加上不良的生活习惯人们很容易肥胖。而肥胖是极其需要关注的公共健康问题,它的发生发展会造成很多其他的疾病。例如糖尿病,据国际糖尿病协会预计,到2045年将会有7.83亿人(占12.2%)患糖尿病,这俨然成为了当今社会的公共卫生问题之一[1]。2型糖尿病主要是由于胰岛素抵抗和胰岛β细胞损伤所造成的[2],目前关于糖尿病尚且没有很好的药物治疗,因此大量的药物靶点研究显得必要且迫切。

青黛的主要化学成分有靛蓝、靛玉红和色胺酮等[3],具有抗炎和调节免疫作用[4],抗细菌和病毒[3]、抗氧化[5]、抗肿瘤[6]等作用。目前关于青黛治疗糖尿病的研究较少,青黛联合抗生素用于治疗糖尿病皮肤病的效果好于抗生素组[7]。根据临床研究,从肝论治青黛石膏汤加减治疗非胰岛素依赖性抵抗的临床观察显示,66例患者的有效率是81.8%[8]。然而当前关于青黛治疗2型糖尿病的作用机制和靶点尚不明确。

1 材料与方法

1.1 化学成分的建立

搜索网页TCMSP数据库(https://tcmsp-e.com/)[9]在草本选项里面检索“青黛”,设置筛选条件为OB(口服利用度)>30、DL(类药性)>0.18,用Uniprot数据库[9](https://www.uniprot.org/)将靶点的蛋白名转化成标准的基因名格式。

1.2 靶点的筛选与建立

利用 GeneCards 数据库[10](https://www.genecards.org/)在“Explore a gene”选项下以“Type 2 diabetes”为搜索指令,筛选出与2型糖尿病相关的基因靶点,将2型糖尿病的基因靶点和青黛基因靶点导入Venny2.1.1网页绘制维恩图。

1.3 关键靶点PPI网络构建

将上述1.2步骤中筛选出的青黛-2型糖尿病的交集靶点输入到String数据库[11](https://cn.string-db.org/)的List of name 列表中将Organisms选为Homo sapiens(人类)构建靶点互作网络图(PPI),置信度为0.9,将蛋白互作图中前十蛋白筛选出来可视化分析,然后将青黛-成分-靶点可视化分析。

1.4 GO生物过程富集分析和KEGG信号通路

Step 1:将青黛-2型糖尿病的交集靶点导入DAVID数据库[12](https://david.ncifcrf.gov/),点击Analysis Wizard将共有基因复制到Gene List,Step 2:在“select Identifier”选项下选择“official-gene-symbol”,再在“select species”选项下选择“Homo sapiens”,Step 3:选择gene list,Step 4:submit list。选择go和kegg,将下载的文件导入基迪奥专业测序服务[13](https://www.omicshare.com/tools/Home/Soft/getsoft),选择工具-气泡图进行GO生物过程分析和KEGG的信号通路分析,结果以气泡图的形式展现。

1.5 药物成分与靶点分子对接

将青黛所有的活性成分导入SYBYL-X 2.0软件模板中进行最小量化,“Docking suit-Dock Ligands”指令将STAT3、JUN、MAPK3三个靶点蛋白晶体结构与青黛有效成分进行一一对接,去除水分、修复侧链和加氢并选择自动寻找活性位点。STAT3的晶体结构(ID:6NJS)、JUN的晶体结构(ID:6Y3V)、MAPK3的晶体结构(ID:3FHR)下载于RCSB PDB数据库[14](https://www.rcsb.org/)。

2 结果

2.1 青黛活性成分的筛选

通过TCMSP数据库草本选项检索“青黛”,总共得到青黛化学成分29个,以OB≥30、DL≥0.18 为筛选条件,筛选出活性成分9个:双靛蓝bisindigotin(MOL011100)、印地安indican(MOL011105)、10h茚多洛10h-indolo,[3,2-b],quinoline(MOL011332)、异靛蓝Isoindigo(MOL011335)、靛Indigo(MOL001781)、6-(3-氧代辛啉-2-亚基)吲哚并[2,1-b]喹唑啉-12-酮6-(3-oxoindolin-2-ylidene)indolo[2,1-b]quinazolin-12-one(MOL001781)、茚地鲁宾indirubin(MOL002309)、β-谷甾醇beta-sitosterol(MOL000358)、异牡荆素isovitexin(MOL002322)。

表1 青黛活性成分及靶标数

2.2 青黛和2型糖尿病相关靶点的筛选

结果如图1所示,2型糖尿病的基因总共有15668个,其中score>10共得到2型糖尿病相关的靶点基因5196个,青黛活性成分靶点236个,青黛靶点和2型糖尿病靶点的交集基因共204个,其中的靶点有:醇脱氢酶1C (alcohol dehydrogenase 1C,ADH1C)、前列腺素- 内过氧化物合酶1(prostaglandin-endoperoxide synthase 1,PTGS1)、前列腺素- 内过氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)、核受体共激活剂2(nuclear receptor coactivator 2,NCOA2)、胆碱能受体毒蕈碱3 (cholinergic receptor muscarinic 3,CHRM3)、胆碱能受体毒蕈碱1 (cholinergic receptor muscarinic 1,CHRM1)、类视黄醇X受体α(retinoid X receptor alpha,RXRA)、乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,ACHE)等。

图1 青黛活性成分靶点和糖尿病靶点交集

2.3 青黛抗2型糖尿病的直接作用靶点拓扑参数分析与成分靶点可视化

将青黛和2型糖尿病的交集靶点导入String在线网页中(图2),得到的治疗2型糖尿病的靶点很多,根据度值大小筛选出前十靶点(表2)为:信号传感器和转录激活剂3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)、原癌基因(Jun proto-oncogene,JUN)、丝裂原活化蛋白激酶 3(mitogen-activated protein kinase 3,MAPK3)、丝裂原活化蛋白激酶 14(mitogen-activated protein kinase 14,MAPK14)、丝裂原活化蛋白激酶 1(mitogen-activated protein kinase 1,MAPK1)、雌激素受体1(estrogen receptor 1,ESR1)、丝氨酸/苏氨酸激酶1 (AKT serine/threonine kinase 1,AKT1)、肾上腺素受体 α 2A (adrenoceptor alpha 2A,ADRA2A)、肿瘤蛋白p53(tumor protein p53,TP53)、Sp1转录因子(Sp1 transcription factor,SP1)、表面活性剂蛋白B (surfactant protein B,SFTPB)、原癌基因(RELA proto-oncogene,RELA)、雌激素受体1(estrogen receptor 1,ESR1),其中STAT3(Degree=47)、JUN(Degree=45)、MAPK3(Degree=44)等3个靶点综合排名前三。节点代表潜在目标,边代表靶点之间的相互作用,每个节点的边数被定义为“degree”,即为度值。节点形状越大和颜色越深,说明此节点对应的相关靶点越重要。以边表示两个靶点之间的关联性,边越粗,靶点之间的关联越显著。通过PPT网络图筛选出前十个蛋白互作图,如图3所示,是degree前十的十个蛋白相互作用的靶点图,3个深色为度值最高的,说明这些青黛靶点在治疗2型糖尿病中具有重要作用。图4即为青黛-成分-靶点的可视化,根据筛选出的青黛有效成分、青黛和2型糖尿病交集靶点来做图,三角形代表青黛,六边形代表青黛有效成分,圆形代表青黛与2型糖尿病的交集靶点。依据图示,青黛可能通过这些有效成分作用于靶点蛋白发挥药效作用。

图2 蛋白互作网络图

图3 前十靶点蛋白互作图

表2 关键靶点top10

2.4 GO生物学功能富集分析

在David数据库中导入青黛和2型糖尿病的交集基因204个,选择其中 GO生物过程(biological process,BP),生物学功能富集分析共得到生物学富集结果 950条,将其中前20条生物过程富集以气泡图的形式展现(图5),其中前3位的富集过程包括:RNA聚合酶II前驱体转录正向调控(positive regulation of transcription from RNA polymerase II promotor)、药物反应(response to drug)、基因表达的正向调控(positive regulation of gene expression),分析显示青黛改善糖尿病可能发生发展在RNA聚合酶II前驱体转录正向调控等过程。

图5 GO生物学功能富集结果气泡图

2.5 KEGG通路分析

在David数据库中导入青黛和2型糖尿病的交集基因204个,选择KEGG信号通路(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)分析,得到信号通路 188条,前20条通路进行展示(图6),其中前3条通路包括:癌症通路类(pathways in cancer)、 糖尿病并发症中的AGR-GAGE信号通路(AGR-GAGE signaling pathway in diabetic complications)、脂质和动脉粥样硬化乙型肝炎(Lipid and atherosclerosis Hepatitis B),这些通路大多与JUN、STAT3、MAPK3蛋白有关。

图6 KEGG富集结果气泡图

2.6 分子对接结果

根据PPI蛋白互作网络图和表2的结果选择了度值排名前三的3个蛋白,将蛋白与青黛活性成分进行对接,以Total Score≥5为筛选条件[15],验证有效成分与关键蛋白之间是否有稳定的结合,结合越紧密,药效越好。以总打分值大于5为标准[15],筛选出对接结果较好的化学成分,将分子与蛋白的结合可视化(图7)。结果发现(表3),MAPK3与异靛蓝(Isoindigo)的结合力不强,关键靶点蛋白STAT3、JUN与有效成分双靛蓝(bisindigotin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、异牡荆素(Isovitexin)有较强的结合,这些化合物在抗2型糖尿病中可能发挥着重要作用。

图7 分子对接可视化

表3 分子对接结果

3 讨论

2型糖尿病主要表现为三多一少:多饮、多食、多尿,体重减少。糖尿病是一种慢性疾病,其病因复杂,靶点多,且中药的有效成分也是多成分、多靶点共同作用,在验证机制的过程中将青黛采用网络药理学的方式筛选出活性成分进行验证。

青黛筛选出有效成分9个,青黛与2型糖尿病的交集基因共有204个,通过蛋白互作筛选出10个关键蛋白中的前三蛋白与有效成分结合,其中3个有效成分双靛蓝(bisindigotin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、异牡荆素(Isovitexin)与STAT3和JUN结合较强。GO富集分析发现,最显著的是RNA聚合酶II前驱体转录正向调控过程,此过程涉及炎症反应、细胞凋亡等产生的炎症因子会加剧细胞黏附,产生胰岛素抵抗,在T2DM过程RNA聚合酶II前驱体转录正向调控表达会上调DEGs[16],是可能发挥抗2型糖尿病的生物过程,KEGG通路富集分析糖尿病最可能发生的通路是癌症类通路,其中T2DM与癌症类PI3K-AKT信号通路[17]有关,发现通路上的mTOR水平在癌症和T2DM上表达上调,在胰岛组织中表达下调,说明T2DM和癌症激活了PI3K-AKT通路上的相关蛋白,则治疗T2DM要抑制通路上的蛋白,同时癌症类通路中的JNK信号通路和STAT3信号通路也可能发挥了治疗2型糖尿病的作用。然而青黛还能够抑制人结肠细胞炎症模型的促炎因子IL-6的表达而促进抑炎因子IL-10的表达[18]。在青黛与2型糖尿病的共有靶点中筛选出综合评分的前三个蛋白:STAT3、JUN、MAPK3。其中STAT3是一个信号转导和转录激活子,其介导细胞对白介素和其他生长因子的反应,也可以与急性期蛋白启动子IL-6结合,STAT3还参与调控多种细胞凋亡抑制基因的表达。因为胞浆内的巨噬细胞STAT3能刺激白介素-10的分泌,能诱导某些炎症性疾病的发生[19]。JNK信号通路一旦被激活会由胞浆转移到细胞核中发挥作用且JNK信号通路与糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、糖尿病周围神经病变等都有紧密联系[20]。c-jun氨基末端激酶(c-jun,N-terminal kinase JNK)能调节炎症、凋亡和自噬等过程,且JNK信号通路在糖尿病的发生发展过程中起着重要作用[21]。JNK能减轻胰岛素抵抗和β细胞损害,因此可以作为治疗糖尿病的潜在目标,JNK表达下调后,小鼠血糖水平明显降低并且胰岛素的敏感性提高[22]。MAPK3是一种蛋白编码基因且家族成员众多,有JNK、p38MAPK等。因为MAPK3和MAPK1在蛋白质的一级结构上有85%的相似,所以两者生理功能也相同,故经常把MAPK1/3或者ERK1/2合称。但是MAPK3的整体磷酸化水平低于MAPK1,能够诱导脂肪细胞分化形成肥胖[23]。

本研究以网络药理学、分子对接为基础阐释了青黛初步可能防治2型糖尿病的作用蛋白靶点、有效成分及通路,为进一步探究青黛防治2型糖尿病的作用机制提供理论基础。