牡丹皮-赤芍药对治疗川崎病作用机制的网络药理学研究*

冯子娟,周虹宏,阳亭亭,罗武政,黄道超▲

(1重庆医科大学附属儿童医院 儿科研究所 儿童发育疾病研究教育部重点实验室 国家儿童健康与疾病临床医学研究中心 儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地 儿科学重庆市重点实验室,重庆 400014;2重庆医科大学附属儿童医院中医科,重庆 400014)

川崎病(Kawasaki disease,KD)是一种具有系统性、发热性、免疫性特点的全身血管炎[1],主要于5岁以下儿童多发,是引发儿童获得性心脏病的病因之一[2],威胁儿童身体健康。据流行病学调查,全世界有超60个国家报道过川崎病,该病的发病率正在逐年升高,我国也不例外[3-4]。当前研究中,KD的病因及机理尚不清晰。临床上诊断KD主要通过结膜炎、多形性皮疹、淋巴结病、手脚水肿等症状,西医中的治疗主要为联合静脉注射免疫球蛋白与阿司匹林、依那西普等生物制剂[4-5]。川崎病在中医里面无对应病名。根据KD临床特点及发展过程,主要将其归类于“温病”范畴,病机主为外感温热毒邪,侵犯肺卫,化火入营血,流窜、壅滞于皮肤、黏膜、经脉、四肢,治疗多以卫气营血辨证,以透邪解毒、清热凉血、润燥养阴等为法[6]。

古籍《神农本草经》中首次提到牡丹皮(Cortex Moutan),书中记载其特征为“味苦辛寒,主治寒热,中风,除癥坚,安五脏,疗痈疮”[7]。明代《本草纲目》中提到牡丹皮能“和血生血凉血,治血中伏火”,具有“清热凉血”之功[8-10]。芍药首记于《神农本草经》,后陶弘景将其分为赤、白两类。《滇南本草》评价赤芍(Radix Paeoniae Rubra)可“泄脾火,降气,行血,退血热”,属清热凉血药类,主用于热入营血、肝郁胁痛、疮疡痈肿等病证[11-12]。临床治疗中,牡丹皮-赤芍常作为相须配伍使用之药对,显协同增效之力,对温病热入营血之发斑吐衄,血行阻瘀之肢麻体木、关节痹痛等具有显著疗效。基于临床复方结合数据挖掘发现:牡丹皮-赤芍是中药处方中治疗川崎病的常用核心药对[13]。然而,牡丹皮-赤芍对治疗川崎病的作用机制尚不清晰,仍待深入探究。

随着科技进步,研究中医药作用的方法中发展出一门新技术——网络药理学。中药和疾病的靶点、基因、通路等互作机理可通过网络药理学方法对多学科内容与技术进行系统的、多角度的阐释。本研究基于网络药理学方法初步探讨牡丹皮-赤芍药对治疗川崎病的可能机制,以期为深入研究提供理论支持,为临床治疗提供指导参考。

1 资料与方法

1.1 牡丹皮-赤芍药对活性成分及靶点

TCMSP数据库[14](https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)中,以口服生物利用度(OB≥30 %)、类药性(DL≥0.18)为条件,搜索整理牡丹皮-赤芍药对的活性成分。药对靶点也经TCMSP数据库进行查询。然后,基于Uniprot数据库[15](https://www.uniprot.org/)和perl语言工具,整理出药对预测靶点。

1.2 牡丹皮-赤芍药对治疗川崎病靶点的预测及筛选

以“kawasaki disease”为关键词,通过GeneCards数据库[16](https://www.genecards.org/)、OMIM数据库[17](https://www.omim.org/),搜索去重找到KD靶点集。对疾病和药对相关靶点取交集,利用Draw Venn Diagram[18](http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)行韦恩图可视化。

1.3 牡丹皮-赤芍-川崎病靶点调控网络构建与蛋白质相互作用网络构建

利用perl语言工具对上述获得的药对-疾病交集靶点进行处理,得到Type和Network文件,将它们导入Cytoscape3.7.2软件[19]进行可视化网络构建。将交集靶点导入STRING数据库[20](https://cn.string-db.org/),依次选择“Multiple proteins”“Homo sapiens”,设置0.7的置信度。下载最终PPI网络“string_interactions.tsv”文件,并将其导入Cytoscape3.7.2软件作美化处理。利用该软件的Cytohubba插件筛出PPI网络的hub基因。

1.4 富集功能分析

通过R x64 4.1.2软件的“ClusterProfiler”“pathview”“colorspace”等程序包[21]分析共有靶点的GO功能和KEGG通路情况,以P<0.05为筛选条件,做条形图或气泡图可视化。

1.5 分子对接

使用Pubchem数据库[22](https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载牡丹皮-赤芍药对的2D化合物结构,通过3D Chem工具转成3D格式并保存。利用RCSB PDB数据库[23](https://www.rcsb.org/)得到治疗KD有关靶点蛋白的文件,在PyMOL软件[24]中进行去水、去小配体预处理。然后,通过AutoDock Vina软件[25]进行分子对接,根据活性成分与核心靶点最低结合能的值来评价化合物和靶点之间的相互作用。

2 结果

2.1 牡丹皮-赤芍药对活性成分及靶点信息

依据上述筛选标准,获取牡丹皮-赤芍药对的活性化学成分,且结合文献、药典内容,得到牡丹皮活性成分12个,赤芍28个,其中4个有效成分为两药共有(表1)。筛选去重整理出牡丹皮活性成分对应靶点155个,赤芍对应靶点88个。

表1 牡丹皮-赤芍药对中主要活性成分

2.2 川崎病潜在靶点

通过OMIM和GeneCards数据库检索KD致病基因,合并保留唯一值得到KD有关靶点1619个。利用Venn工具制图分析,将牡丹皮-赤芍药对潜在靶点与KD潜在靶点取交集,得到药对-疾病靶点100个(图1)。

图1 牡丹皮-赤芍-川崎病靶点韦恩图

2.3 牡丹皮-赤芍-成分-靶点-疾病网络

“牡丹皮-赤芍-化学成分-靶点-疾病”网络经Cytoscape3.7.2软件构建(图2)。12个化合物和100个潜在靶点构成此网络。牡丹皮-赤芍药对中度值靠前的活性成分有MOL000098(槲皮素,Degree=81)、MOL000422(山柰酚,Degree=30)、MOL002714(黄芩素,Degree=21)、MOL000358(β-谷甾醇,Degree=14)。节点连接数越多,靶点就越大,表示其在网络的位置越重要。HSP90AB1、PTGS2、ESR1、AR、CASP3是度值排名靠前的靶点。此网络体现了牡丹皮-赤芍药对是通过多个成分和多个靶点的方式来治疗川崎病。

注:黑色圆形代表牡丹皮潜在活性成分,白色圆形代表赤芍潜在活性成分,灰色矩形代表中药与疾病的潜在交集靶点。图2 牡丹皮-赤芍-化学成分-靶点-疾病网络图

2.4 PPI网络与核心靶点筛选

将药对-疾病靶点导入STRING数据库分析网络,利用Cytoscape3.7.2软件作可视化处理(图3)。该网络拥有95个节点和648条边。以节点大小代表Degree值,值越大的节点就越大,说明此节点位于网络的关键位置。该PPI网络Degree值较大的靶点有AKT1、TP53、JUN、CASP3等,推测其为治疗川崎病的关键靶点。经CytoHubba插件筛出前10位的Hub基因(图4)。显示川崎病可能通过MYC、HIF1A、AKT1等靶点发挥作用,达到治疗效果。

图3 牡丹皮-赤芍药对治疗KD潜在靶点的PPI网络

图4 PPI网络的hub基因

2.5 富集功能分析

中药-疾病的交集靶点利用R语言分析GO功能和KEGG通路情况。GO功能条形图见图5。横坐标为富集靶点数,富集靶点的显著性用P值表示。P值越小,颜色越浅,反之越深。结果显示,BP相关条目数最多,有1883条,主要与细胞对外刺激的反应、对生物刺激的反应及氧化应激反应等相关。CC相关条目数有40条,主要包含细胞膜和蛋白激酶复合物。MF相关条目数有147条,主要包含DNA结合转录、RNA 聚合酶Ⅱ特异性、泛素样蛋白连接酶结合等。

图5 中药治疗KD潜在靶点的GO富集分析条形图

KEGG通路分析气泡图见图6。富集靶点数目的多少以圆圈大小表示,即圆圈越大,富集靶点数越多。富集靶点的显著性用P值表示,P值越小,颜色越浅,反之越深。富集结果显示,共168条信号通路,主要涉及AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路等,在脂质沉积、动脉粥样硬化、炎症等过程中发挥关键作用。

图6 中药治疗KD潜在靶点的KEGG通路富集气泡图

2.6 分子对接结果

将上述得到的槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)与PPI网络里的关键靶点(JUN、AKT1、CASP3)进行对接(表2)。通常,结合能小于-5 kcal/mol表明结合活性较好,小于-7 kcal/mol表明结合稳定[26]。由结果可知,蛋白受体与药物小分子配体的结合亲和力均小于-5 kcal/mol,说明核心化合物与关键靶点均具有潜在活性效果。

表2 牡丹皮-赤芍药对治疗KD的核心化合物与关键靶点的结合能

3 讨论

本文采用网络药理学方法,对牡丹皮-赤芍治疗川崎病的核心化合物、靶点及作用机制进行探究。结果显示,牡丹皮-赤芍药对治疗川崎病的核心化合物主要涉及槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、黄芩素等。基于PPI网络筛选核心靶点,分析出10个关键靶点(AKT1、JUN、CASP3等)与川崎病有紧密联系。将牡丹皮-赤芍药对活性成分中的槲皮素、山柰酚与靶点JUN、AKT1、CASP3进行分子对接,发现结合亲和力均低于-5 kcal/mol,具有较好的结合度。因此,推测牡丹皮-赤芍药对的有效成分可与上述相关靶点相互作用产生治疗效果。

黄酮类化合物(黄芩素、槲皮素、山柰酚等)对抑制炎症细胞因子和氧化应激具有重要作用。异丙肾上腺素诱导的心肌损伤大鼠模型中,黄芩素可减轻氧化应激和抑制致炎因子释放,达到保护心脏的作用[27]。槲皮素和山柰酚可通过下调NF-κB、TNF、NLRP3、IL-6等表达并抑制氧化应激,从而减轻炎症损伤[28-31]。β-谷甾醇具有抗炎、抗氧化的作用。文献指出,谷甾醇可通过LR4/Nrf2/ERK1/2/JNK等信号通路,下调ROS、MDA以及IL-6、TNF-α水平,以此缓解氧化应激损伤,改善炎症反应[32-34]。因此,牡丹皮-赤芍治疗KD的关键化合物可通过下调炎症因子表达、激活相关通路等,进而产生药理作用。

AKT1参与细胞增殖、存活、生长和血管生成等过程,能调节VEGF介导的血管生长,从而减缓心功能受损[35-37]。JUN是活化蛋白-1(AP-1)转录复合物中的一种,其可调节表皮生长因子受体(EGFR)的表达,参与增殖、凋亡等生物过程[38-39]。CASP3是调控细胞凋亡过程的关键位点,研究显示,下调CASP3表达,可降低酒精性肝损伤、减轻缺血再灌注损伤导致的脑梗死体积[40-41]。此外,也有研究证实了川崎病患者冠状动脉病变的形成与CASP3有关[42]。

据GO功能和KEGG通路富集结果,牡丹皮-赤芍药对可通过细胞氧化应激反应、抗细胞凋亡作用等网络方式缓解川崎病,其作用的信号通路可能同TNF信号通路、IL-17信号通路、PI3K-Akt信号通路等相关。

综上所述,牡丹皮-赤芍药对治疗川崎病的作用机制可能是槲皮素、黄芩素、山柰酚、β-谷甾醇等成分作用于AKT1、JUN、CASP3等相关靶点发挥药效,并可经TNF信号通路、IL-17信号通路、PI3K-Akt信号通路等调控氧化应激、炎症细胞因子水平、血管内皮等起到治疗川崎病的效果。该研究为治疗川崎病的药效物质基础和通路机制研究提供了新的理论参考,为后续实验验证提供依据。