糖足散质量控制方法的初步研究

徐璐娜，周玉芳，阮洪生，陈 云，王翰华，王又迪

（1.浙江药科职业大学中药学院，宁波 315503；2.浙江医院药剂科，杭州 310013）

糖尿病足是老年糖尿病患者致残的严重慢性并发症之一[1]。现阶段中医对糖尿病足的体外治疗，主要采取的处理方法有中药足疗熏洗、中药外敷涂抹等[2-4]。糖足散是浙江医院中医科应用多年的协定处方，由红花等9 味中药组成。方中红花、当归、牛膝温通散寒、活血化瘀，合为君药。桂枝、醋乳香、细辛辛温通络，配合君药散寒活血，三药为臣。赤芍，清热凉血，发挥佐制之用。凤仙透骨草、桑枝引诸药透入经络、血脉，通达四肢而祛风、活血、止痛。糖足散熏洗患者足部能扩张血管内径，加快患肢血液运行，改善足部微循环，用糖足散协助弥可保治疗早期糖尿病足，临床疗效显著[5]。本实验对糖足散进行了初步的定性定量研究，为其质量标准的完善与提升提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

BK6000 型显微镜（重庆奥特光学仪器有限公司）；Good Look-2000 型薄层色谱成像系统（上海科哲生化科技有限公司）；UV-6100 型紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；FA2004 型电子分析天平（上海恒平科学仪器有限公司）；HH-2 型恒温数显水浴锅（常州国华电器有限公司）；HY-08 型高速粉碎机（北京环亚天元机械技术有限公司）。

1.2 材料

当归、红花、牛膝对照药材（批号：120927-201617、120907-201412、121066-201809），β-蜕皮甾酮、人参皂苷Ro 对照品（批号：111638-201706、111903-201604）均购自中国食品药品检定研究院；芦丁对照品（批号：B20771，纯度98%）购自上海源叶生物科技有限公司；中药饮片均购自杭州华东饮片有限公司；葡萄糖标准溶液1000 mg/L、3,5-二硝基水杨酸试液（Phygene）；娃哈哈纯净水；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 糖足散样品制作

称取当归、红花等中药饮片适量，分别粉碎成粉末（过3 号筛），按糖足散处方中比例（当归、赤芍、牛膝、桂枝、透骨草各18 g、桑枝24 g、红花12 g、醋乳香10 g、细辛6 g）混匀，即得糖足散样品。

2.2 显微鉴别[6]

取糖足散样品粉末适量，制片、观察，并描述其显微特征。本品粉末红棕色，花粉粒类圆形或椭圆形，直径约60μm，外壁具有短刺和点状雕纹，3 个萌发孔（红花）；石细胞呈类圆形、类方形或类长方形，壁一面菲薄（桂枝)，或壁厚，胞腔小（桑枝）；草酸钙方晶，直径5～20μm（桑枝），草酸钙簇晶，直径15～30μm（赤芍）；不规则团块无色或淡黄色，表面及周围扩散出众多细小颗粒，久置溶化（醋乳香）；非腺毛由多个细胞构成，部分细胞内含棕色物质（凤仙透骨草）。详见图1。

图1 糖足散显微特征(40×)

2.3 薄层鉴别

2.3.1 阴性样品制作

按“2.1”项下方法，分别制作缺当归、缺红花、缺牛膝、缺赤芍、缺桂枝、缺细辛的阴性样品。

2.3.2 当归[6]

取糖足散样品4 g（含当归0.5 g），加乙醚50 mL，回流提取1 h，取滤液，低温挥干，加乙醇1 mL 溶解残渣，即得供试品溶液。取缺当归的阴性样品3.5 g，当归对照药材0.5 g，按上述方法分别制备阴性样品溶液、对照药材溶液。吸取上述溶液各5 μL，按序点于同一硅胶G 薄层板，展开系统选正己烷-乙酸乙酯（4∶1），于365 nm 紫外光灯下观察。

2.3.3 红花[6]

取糖足散样品5.9 g（含红花0.5 g），加80%丙酮溶液20 mL，超声20 min，取续滤液，即得供试品溶液。取缺红花的阴性样品5.4 g，红花对照药材0.5g，按上述方法分别制备阴性样品溶液、对照药材溶液。吸取上述溶液各20 μL，按序点于同一硅胶H 薄层板，展开系统选乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇（7∶2∶3∶0.4），于日光下观察。

2.3.4 牛膝[6]

取糖足散样品10 g（含牛膝1.3 g），加80%甲醇100 mL，回流提取4 h，取滤液，蒸干，加温水5 mL 溶解残渣，转移至D101 型大孔吸附树脂柱，用水、20%乙醇各100 mL 先后洗脱柱子（弃洗脱液），再用80%乙醇100 mL 洗脱，收集、蒸干洗脱液，加80%甲醇1 mL 溶解残渣，即得供试品溶液。取缺牛膝的阴性样品8.7 g、牛膝对照药材1.3 g，按上述方法分别制备阴性样品溶液，对照药材溶液。再取β-蜕皮甾酮对照品、人参皂苷Ro 对照品，加甲醇分别制成0.5 mg/mL 的对照品溶液。吸取上述溶液各15 μL（对照品溶液10 μL），点于同一硅胶G 薄层板，展开系统选二氯甲烷-甲醇-水-甲酸（14∶6∶1∶0.1），5%香草醛硫酸溶液喷淋，105℃加热，斑点呈色清晰后观察。

2.3.5 薄层鉴别结果

当归、红花、牛膝薄层色谱图中，主斑点清晰，阴性无干扰。详见图2～4。

图2 当归薄层色谱

图3 红花薄层色谱

图4 牛膝薄层色谱

2.4 糖足散总黄酮含量测定

2.4.1 对照品溶液制备

取芦丁对照品（纯度：98%）11.5 mg，精密称定，置50 mL 容量瓶中，加70%乙醇40 mL，置水浴上微热使溶解，放冷，加70%乙醇至刻度，摇匀，即得（质量浓度为0.2254 mg/mL）。

2.4.2 供试品溶液制备

取糖足散3 g，精密称定，置250 mL 锥形瓶中，加水135 mL（料液比1∶45），浸泡30 min，水浴加热回流提取0.5 h，提取液减压抽滤，滤液转移至250 mL 容量瓶中，加水定容，摇匀，即得。

2.4.3 样品测定

精密移取待测溶液2mL 于25mL 容量瓶中，加水至6mL，加5%亚硝酸钠溶液1mL，混匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1mL，混匀，放置6min，加氢氧化钠试液10mL，再加水至刻度，摇匀，放置15min。以相应试剂为空白，按照紫外-可见分光光度法[6]，在310nm波长下检测。

2.4.4 检测波长的选择

精密量取“2.4.1～2.4.2”项下对照品溶液3 mL、供试品溶液2 mL，分别置于25 mL 容量瓶中，按“2.4.3”项下方法，自“加水至6 mL”开始，依法操作，在250～600 nm 波长范围内进行扫描，发现在310 nm 波长处有较大的吸收且信号较稳定。综合考虑后，最终选用310 nm 作为本实验最终检测波长。

2.4.5 正交试验考察水提工艺

在水浴工作状态下，设计四因素三水平L9（34）正交试验，考察料液比（1∶25、1∶35、1∶45）、浸泡时间（30、60、90 min）、提取温度（80、90、100℃）、提取时间（0.5、1.0、1.5 h）对糖足散中总黄酮含量的影响，最终以直观分析结果结合节能高效的原则，确定了最佳提取参数，即液料比1∶45，浸泡时间30 min，提取温度100℃，提取时间0.5 h。

2.4.6 线性关系考察

精密移取“2.4.1”项下对照品溶液1、2、3、4、5、6 mL 分别置于25 mL 容量瓶中，制成质量浓度为9.02、18.03、27.05、36.06、45.08、54.10 μg/mL 的标准溶液，分别按“2.4.3”项下方法测定，用吸光度、对照品质量浓度分别作纵、横坐标，得回归方程：Y=0.019 4X+0.007 5（R2=0.999）。芦丁在9.02～54.10 μg/mL 范围内线性关系良好。

2.4.7 精密度试验

精密移取芦丁对照品溶液3 mL，按“2.4.3”项下方法，重复测定6 次。结果对照品溶液吸光度RSD 为0.39%，表明该仪器精密度良好。

2.4.8 重复性试验

精密移取同一份供试品溶液6 份，每份2 mL，按“2.4.3”项下方法测定吸光度，计算得到总黄酮百分含量RSD 为1.82%，表明该方法重复性良好。

2.4.9 稳定性试验

分别精密移取对照品溶液3 mL、供试品溶液2 mL，按“2.4.3”项下方法操作，分别于0、10、20、30、40、50 min 测定。结果对照品溶液、供试品溶液吸光度RSD 分别为1.82%、0.80%，表明50 min 内上述两种溶液稳定性较好。

2.4.10 加样回收率试验

称取已知含量的糖足散粉末0.15g，共6 份，置于25 mL 锥形瓶中，分别加入芦丁对照品适量，加水13.5 mL，浸泡30 min，水浴加热回流提取0.5 h，提取液减压抽滤，滤液转移至25 mL 容量瓶中，加水定容，摇匀，即得供试品溶液，测定吸光度，计算回收率。结果见表1。

表1 总黄酮回收率结果（n=6）

2.4.11 样品含量测定

称取3 g 糖足散粉末3 份，按“2.4.2”项下供试品溶液制备法制备，按“2.4.3”项下方法操作测定。结果样品中总黄酮平均含量为3.042%（RSD=2.00%）。

2.5 糖足散多糖含量测定

2.5.1 对照品溶液的制备

取葡萄糖标准溶液（1000 mg/L），按需求稀释。

2.5.2 供试品溶液的制备

2.5.2.1 单糖供试品溶液的制备

称取糖足散50 mg 于50 mL 容量瓶中，加超纯水适量，振摇使溶解，用超纯水定容至刻度，摇匀，用直径0.80 μm 的滤膜滤过，取续滤液即得，备用。

2.5.2.2 总糖供试品溶液的制备

称取糖足散50 mg 于100 mL 磨口三角瓶中，先加盐酸（1→2）20 mL，置沸水浴中10 min，取出，静置，待放冷后用40%氢氧化钠溶液调节pH 值至中性，然后移入100 mL 的容量瓶中，用纯净水稀释，定容至刻度，摇匀，用直径为0.80 μm 滤膜滤过，取续滤液25 mL 至50 mL 容量瓶中，用纯净水稀释，定容至刻度，摇匀即得，备用。

2.5.3 样品测定

精密量取待测溶液4mL，置于20mL 具塞比色管中，加入DNS 试液2mL，摇匀，放置沸水浴中加热7min，取出后放入冰水中冷却至室温，加纯净水6mL，摇匀，平行作空白，按照紫外分光光度法[6]，在515nm波长下检测。

2.5.4 检测波长的选择

分别精密量取“2.5.1～2.5.2”项下对照品溶液适量、单糖溶液与总糖溶液各4 mL，置于20 mL 的具塞刻度试管中，分别按照“2.5.3”项下方法，自“加入DNS试液2mL”开始，依法操作，在470～700 nm 波长范围内进行光谱扫描。结果显示三种溶液在515 nm 左右波长下有最大吸收。综合考虑后，选用515 nm 作为检测波长。

2.5.5 DNS 用量的考察

取5 支20 mL 具塞比色管，分别精密加入葡萄糖对照品溶液1 mL，补纯净水至4 mL，分别准确加入DNS 试液1、2、3、4、5 mL，放入沸水浴中加热5 min，取出后立即用冰水浴冷却至室温，加纯净水稀释，定容至刻度，摇匀后测定各自吸光度。详见图5。当用量为2 mL 时，吸光度已达最大值。

图5 DNS 用量与吸光度的关系

2.5.6 反应时间考察

精密量取葡萄糖对照品溶液1 mL 至20 mL 比色管中，分别补纯净水至4 mL，加入DNS 试液2 mL，分别放入沸水浴中1、3、5、7、9 min，取出后立即用冰水浴冷却至室温，加纯净水稀释，定容至刻度，摇匀后测定各自吸光度。详见图6。由图6 可知，显色反应时间为7 min 时，测定的吸光度值达到最大，故选7 min为本实验最佳显色反应时间。

图6 显色时间与吸光度的关系

2.5.7 标准曲线绘制

分别精密吸取葡萄糖标准溶液（1000 mg/L）1、1.5、2、2.5、5、6.25mL 于25mL 容量瓶中，依次加纯净水稀释，定容至刻度，摇匀，即得。精密量取不同浓度对照品溶液各4 mL，按照“2.5.3”项下方法测定，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度A 为纵坐标，回归方程为：Y=5.112 9X-0.200 5（R2=0.999 8），表明葡萄糖在0.04～0.25 mg/mL 范围内线性关系良好。

2.5.8 精密度试验

精密量取葡萄糖标准溶液（1000 mg/L）2.85 mL，置于25 mL 容量瓶中，加纯净水稀释，定容至刻度，得所需对照品溶液。按样品测定方法重复测定6 次。结果对照品溶液吸光度RSD 为0.18%，表明该仪器精密度良好。

2.5.9 稳定性试验

分别精密量取对照品溶液（按精密度试验项下的对照品溶液配制）、单糖溶液、总糖溶液各4 mL，按照样品测定方法测定，于0～50 min 内每隔10 min 测定1 次，结果各组溶液吸光度RSD 值均≤2%，可认为3种溶液在50 min 内稳定。

2.5.10 重复性试验

精密移取同一份单糖供试品溶液6 份，每份4 mL，分别置于20 mL 的具塞比色管中，按照样品测定方法测定，总糖供试品溶液的测定操作同上。结果单糖溶液吸光度RSD 为1.92%；总糖溶液吸光度RSD为1.58%，显示该方法重复性良好。

2.5.11 加样回收率试验

2.5.11.1 单糖加样回收率试验

对照品溶液配制：精密量取葡萄糖标准溶液（1000 mg/L）1.70 mL，置于25 mL 容量瓶中，加纯净水稀释，定容至刻度，摇匀即得，备用。配制糖足散单糖溶液6 份，分别移取2 mL 单糖样品溶液置于20 mL 的具塞比色管中，分别加入2 mL 对照品溶液，按照样品测定方法测定。测得单糖平均回收率为98.19%，RSD 为2.32%，结果见表2。

表2 单糖回收率结果（n=6）

2.5.11.2 总糖加样回收率试验

对照品溶液配制：精密量取葡萄糖标准溶液（1000 mg/L）2.85 mL，置于25 mL 容量瓶中，加纯净水稀释，定容至刻度，摇匀即得，备用。配制糖足散总糖溶液6 份，分别移取2 mL 总糖样品溶液置于20 mL 的具塞比色管中，分别加入2 mL 对照品溶液，按照样品测定方法测定。测得总糖平均回收率为103.03%，RSD 为1.77%，结果见表3。

表3 总糖回收率结果（n=6）

2.5.12 样品多糖含量测定

按“2.5.2”项下分别制备单糖供试品溶液和总糖供试品溶液各6 份，按照样品测定方法测定，依法显色，测定吸光度并计算各自含量，再按“多糖含量=（总糖含量-单糖含量）×0.9”计算多糖含量。结果样品中单糖的平均含量为7.470%（RSD=3.00%），总糖的平均含量为46.423%（RSD=2.79%），代入上式，算得多糖含量为35.058%。

3 讨论

显微鉴别中，透化技术的灵活运用是镜下观察清晰与否的关键。试验中发现对于只需微透化的样品，滴水合氯醛试液后，可尝试略过加热步骤，放置片刻，待其自然透化后再行观察，有时得到的效果会更佳。另外，因糖足散中当归的纺锤形韧皮薄壁细胞相对不易找到，故暂未纳入本文。

薄层鉴别中发现环境温湿度对薄层展开有一定影响。试验前期，牛膝薄层展开环境温度过高，分离不理想，后改在阴凉室中进行，分离度便有所改善。湿度会影响硅胶薄层板的吸附能力，建议使用前对硅胶板进行活化，使板内水分含量保持相对一致，尽量减少对Rf 值重现性的影响。此外牛膝薄层中还发现，因供试品中含较多水溶性杂质，不可贪图方便，省略过柱洗脱环节，否则易出现斑点粘连，各组分难以分离的情况。

黄酮类化合物是一类重要的天然产物，糖足散中多味药材富含黄酮类成分，具抗炎、抑菌等作用[7-9]，对治疗糖足溃疡有一定的疗效，故将总黄酮作为评价糖足散质量的重要指标之一。测定黄酮类化合物含量的方法常见的有高效液相色谱法、紫外分光光度法，但高效液相色谱法更适合单体化合物的分离，因此，采用紫外分光光度法测定糖足散中总黄酮的含量[10]。

糖足散中多味药材含多糖类成分，有抗炎抑菌、抗氧化、抗凝血等活性，可能是治疗糖尿病足的有效组分，故把多糖作为糖足散的一个质控指标[11-14]。目前测定多糖的比色法有很多，常见的是蒽酮-硫酸比色法和苯酚-硫酸比色法，但这两种方法存在缺陷，因单糖类杂质也会与苯酚或蒽酮反应，致使测定结果偏高[15]。另外蒽酮-硫酸比色法，其稳定性受测定条件影响较大（如蒽酮试剂不易保存）[16]。DNS 法测定结果受杂质干扰较小，可排除单糖等杂质带来的误差，且DNS 试剂稳定性较好，因而选择DNS 法测定糖足散多糖[17]。

本文通过定性定量分析，对糖足散质量控制方法进行了初步研究，为其质量标准的制定奠定基础，也为临床安全用药提供保障。