人参皂苷Rg3 脂质体制备工艺优化

赵秋凝，刘雪坤，武子敬，高 媛，李昭熙，刘成琳

（通化师范学院•吉林 通化•134002）

人参皂苷Rg3 属于人参稀有皂苷，主要存在于人参的炮制品红参和黑参中。人参皂苷Rg3 具有良好的抗肿瘤生物学活性[1]。国内研究发现人参皂苷Rg3能通过抑制长链非编码RNA -LINP1（lncRNA -LINP1）的表达，从而抑制胃癌细胞的增殖与迁移，并促进其凋亡，发挥抗癌作用，并且这种作用与Rg3 浓度成正比[2]。目前，市场上有关人参皂苷Rg3 的相关药品主要是参一胶囊。参一胶囊在提高癌症治疗效果的同时还具有补益作用，是癌症患者的常用药[3]，具有效果好、副作用小的优点。

脂质体是由脂质双分子层所形成的封闭囊泡，囊泡内水相和双分子层内可以包裹不同类型的活性药物。与其他传统药物载体系统相比，脂质体基于纳米结构的特点，可改善药物渗透性和溶解性，提高难溶性药物口服生物利用度，通过包载活性药物来改善制剂体内外稳定性，提高疗效，减少毒副作用，改善患者顺应性[4-6]。脂质体经修饰后可以被动或主动靶向肿瘤部位，从而将药物有效递送至靶向部位[7]。通过对脂质体进行一定的结构修饰,如连接甘草次酸及其衍生物等靶头，可发挥配体-受体间的特异性结合作用，促进包载药物的脂质体主动靶向肝组织，提高生物利用度。这种利用配体-受体特异性结合的作用，可为主动靶向其他组织治疗相关疾病的药物递送研究提供参考[8]。因为人参皂苷Rg3 存在水溶性差，生物利用度低的缺点[9],所以利用脂质体材料具有两亲性的特点，可以考虑通过脂质体同时将脂溶性药物包覆，改善人参皂苷Rg3 的生物利用度[10]。本试验采用大豆卵磷脂和胆固醇为载体材料制备人参皂苷Rg3 脂质体，旨在提高人参皂苷Rg3 的生物利用度和其抗肿瘤的靶向性，为人参皂苷Rg3 剂型进行深入研究奠定基础。

1 材料与仪器

1.1 材料、仪器和试剂

1.1.1 材料

大豆卵磷脂（南京都莱生物科技有限公司）；磷脂（天津博迪化工有限公司）；人参皂苷Rg3（成都彼样生物科技有限公司）。

1.1.2 试剂

甲醇，乙腈，均为色谱纯（德国Merck 公司）；磷酸（天津大茂化学试剂厂）；水为娃哈哈纯净水。

1.1.3 仪器

赛默飞高效液相色谱仪（包括自动取样器、四元泵系统、紫外检测器、工作站）；精密电子分析天平（天津天马恒基仪器有限公司）。

2 方法与结果

2.1 人参皂苷Rg3 脂质体供试品溶液的制备

采用薄膜分散法制备人参皂苷Rg3 脂质体，分别取Rg3 提取物、大豆卵磷脂和胆固醇，置烧杯中加15 mL 甲醇，超声溶解后，置梨形瓶中，旋蒸挥去溶剂，梨形瓶中形成均匀的薄膜后，加入适量pH=7.4 的PBS溶液，在一定温度的水浴中水化一段时间，取出冷却至室温，即得Rg3 脂质体。同法制备不加人参皂苷Rg3 原料药的空白脂质体。

2.2 包封率的测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Ultimate Polar RP（250mm ×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈（A）-0.01%磷酸水（B）（50%；50%）；柱温：30℃；检测波长：203nm；进样量：5 μL。

2.2.2 人参皂苷Rg3 对照品溶液的制备

精密称取10.01mg 对照品人参皂苷Rg3，加甲醇并转移到10mL 容量瓶中定容至刻度，即得人参总皂苷对照品溶液（1.001mg•mL-1）。

2.2.3 线性关系考察

精密吸取人参皂苷Rg3 脂质体对照品溶液2、5、10、15、20 μL，按“2.2.1”项下色谱条件，连续进样5次，记录不同进样量的对照品溶液峰面积，以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线Y=59.784X-0.2659，R2=0.9997（n=5），人参皂苷Rg3 含量在0.2～2 μg 时线性关系最好，结果见图1。

图1 人参Rg3 对照品标准曲线图

2.2.4 供试品溶液的制备及包封率的测定

精密量取人参皂苷Rg3 脂质体1mL，置10mL 容量瓶中，加入适量甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，过0.45μL 微孔滤膜，测定脂质体中总的药物量（C总）。精密量取人参皂苷Rg3 脂质体2mL 溶液离心，取上清液0.2 mL 加入适量甲醇溶解并稀释至刻度，超声5 min 破乳，过0.45μL 微孔滤膜（C游离），计算包封率（EE）=C游离/C总×100%。

2.2.5 空白干扰试验

精密吸取对照品溶液、人参皂苷Rg3 脂质体、空白脂质体溶液各10 μL，按“2.2.1”项下色谱条件测定，结果载体对本品含量测定无干扰。详见图2。

图2 人参皂苷Rg3 对照品（A）、人参皂苷Rg3 脂质体（B）、空白脂质体(C)HPLC 图谱

2.2.6 精密度试验考察

分别精密吸取同一供试品溶液10 μL，连续进样6 次，记录峰面积，计算RSD 值为0.89%，表明仪器精密度良好。

2.2.7 稳定性试验考察

分别精密吸取同一供试品溶液10 μL，分别在0、2、4、6、8、10 h 进样10 μL，记录峰面积，计算含量为0.141%，RSD 值为0.73%，表明供试品溶液稳定性良好。

2.2.8 重复性试验考察

取同一黑参样品，按“2.1”项下方法分别制备6 份，依次测定含量，记录峰面积，计算黑参中人参皂苷Rg3含量，RSD 值为0.88%，表明供试品溶液重复性良好。

2.2.9 回收率试验考察

精密称取6 份人参皂苷Rg3 脂质体1mL，分别置于10mL 容量瓶中，精密加入人参皂苷Rg3 对照品溶液，其余按脂质体制备和上述色谱条件依法测定，计算回收率，结果平均加样回收率为99.19%，RSD 值为1.32%，符合规定。

2.3 正交试验优化人参皂苷Rg3 脂质体

本实验以包封率为指标，脂质体选取人参皂苷Rg3 与大豆卵磷脂和胆固醇的质量比（A）、水化体积（B）作为考察因素。详见表1，试验设计及结果见表2，方差分析结果见表3。

表1 因素水平表

表2 正交试验结果

表3 方差分析表

通过表2、表3 分析可知，水化时间对工艺的影响具有显著性，确定最佳制备工艺为：药物与大豆卵磷脂与胆固醇的质量比为1∶1∶6，水化体积为3 mL，水化温度为40℃。

2.4 制备工艺验证

按上述得到的最佳制备工艺，精密称取2mg 人参皂苷Rg3，平行制备三批人参皂苷Rg3 脂质体，测定包封率分别为83.56%、85.11%、86.49%，平均包封率85.05%。表明该制备工艺合理、可行、重复性好，且包封率不低于80%，因此本实验所确定的薄膜水化法的工艺条件，适用于人参皂苷Rg3 脂质体的制备。

3 结论与讨论

本实验采用薄膜分散-超声法制备人参皂苷Rg3脂质体，以包封率为评价指标，考察药物与大豆卵磷脂与胆固醇的质量比、水化体积和水化温度对包封率的影响，最终确定人参皂苷Rg3 脂质体的最佳制备工艺。

脂质体的制备方法有薄膜分散法、注入法、逆向蒸发法等。通过查阅文献发现薄膜分散法和注入法都属于被动载药，应用较多效果较好，前期预试验对比二者发现，通过薄膜分散法得到的人参皂苷Rg3 脂质体包封率较高且粒径较为均匀，故本实验选择薄膜分散法制备人参皂苷Rg3 脂质体。

通过TCMSP 数据库发现人参皂苷Rg3 口服利用度OB 值仅为5.95%（其中OB 值≥30%时，口服利用度较好），因此人参皂苷Rg3 的口服剂型选择显得尤为重要。脂质体是一种人工膜，既具有亲水性，又具有亲脂性，因此能够更好的包裹人参皂苷Rg3，达到较好的口服利用度。