基于网络药理学探究人参、红参、黑参、西洋参和人参叶治疗脾气虚的药效物质基础与作用机制

王晓慧，富 力，窦德强*，张明波*

（1.辽宁中医药大学，大连 116600；2.大连富生天然药物开发有限公司，大连 116600）

人参为五加科植物人参（Panaxginseng C.A.Mey.）的干燥根和根茎[1]；红参为五加科植物人参的栽培品经蒸制后的干燥根和根茎；黑参为人参经“九蒸九晒”的炮制品；西洋参为五加科植物西洋参(Panaxquinquefolium L.）的干燥根；人参叶为五加科植物人参的干燥叶。五种药材都具有补气的作用，人参临床上用于治疗气血亏虚，脾虚食少，肢冷脉微等症。红参临床应用于体虚欲脱，肢冷脉微，气不摄血，崩漏下血等症。西洋参主要作用为补气养阴、清热生津，临床上用于气阴亏虚，虚热烦倦，咳喘痰血等症。人参叶具有补气益肺，滋阴降火，生津止渴等功效。黑参作为一种新型炮制品，研究较少，但已有研究表明黑参具有抗癌、抗氧化和免疫调节等作用[2]。由于脾为后天之本，人参的补脾作用与其大补元气相关。有书籍中记载人参治疗倦怠无力，食欲不振，呕吐泄泻等脾胃虚弱证（现代医学的消化系统疾病如十二指肠溃疡）[3]，因此本文以脾气虚的现代医学疾病—疲劳与肠炎作为研究对象，运用网络药理学方法探究五种药物治疗脾气虚的作用机制及其物质基础。

1 研究策略及思路

本文的研究策略和思路大致如下，目的：通过网络药理学探究五种药物抗脾气虚的药效物质基础，挖掘各药材治疗脾气虚的关键靶点。理论依据：①选择与脾气虚相关的疾病如疲劳、胃炎和肠炎的相关靶点作为五种药物治疗脾气虚的可能作用靶标。②中药功效的科学内涵可以通过共性效应（群）—共性靶标（群）—特征组分（群）加以表征。方法：①以五种药物化学成分作为切入点，采用TCMSP、PubChem 与Swisstargetprediction 对其化学成分和靶点进行发掘、预测。②利用GeneCards 查找脾气虚相关疾病（疲劳与肠炎）的靶点，将五种药物的靶点分别与脾气虚基因做交集得到药物抗脾气虚的作用靶点。③利用String 线上工具构建蛋白互作网络。④用R 软件对各药物靶标进行KEGG 通路富集分析，并利用Cytoscape 绘制化学成分-靶标-通路网络图。⑤通过化合物、靶标与通路的Degree 值与p-value 值筛选出治疗脾气虚的主要活性成分、主要靶标与主要通路。具体过程如图1 所示。

图1 总体研究策略及思路

2 研究方法

2.1 各药材成分及作用靶点的收集

在中药系统药理学数据库与分析平台TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)上，分别查找人参、红参、西洋参和人参叶的主要活性成分及相关靶点。其中口服生物利用度(OB)≥30%，类药性(DL)≥0.18。由于TCMSP 数据库中没有收录黑参，通过查阅相关文献获取黑参的主要活性成分。

2.2 各药材化学成分靶点预测

在Swisstargetprediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)平台中导入各药材活性成分SMILES 格式进行分析，设置属性为“homosapiens”，将概率值大于0 的靶点作为该成分有效靶点。

2.3 脾气虚疾病基因的收集以及交集基因的筛选

利用GeneCards 数据库获取脾气虚相关疾病（疲劳与肠炎）的基因，将数据汇总后去除重复基因并查阅相关文献进行验证，获得脾气虚（疲劳与肠炎）的相关靶点。将五种药材的靶点分别与脾气虚疾病（疲劳与肠炎）基因做交集得到交集基因韦恩图。

2.4 蛋白互作网络及结构构建

在String PPI 蛋白互作网络（PPI）分析数据库(http://string-db.org/)中导入疾病-药物互作蛋白，选择人类数据库，通过调整，设置评分值（置信度）>0.9 后，隐藏游离节点，将上述靶点的蛋白互作信息导入软件Cytoscape3.7.2，生成PPI 蛋白互作网络节点图(PPIN)。

2.5 药材活性成分-靶点网络的构建与分析

将网络文件导入Cytoscape3.7.2 软件，通过Network Analyzer 工具分析网络节点，获取对应拓扑度值（degree），使用cytoscape 软件cytohubba 插件对人参、红参、黑参、西洋参和人参叶的活性成分-靶点连线结果进行打分并作出可视化图，获取对应拓扑度值（degree），筛选出五种药材活性成分的潜在关键作用靶点。

2.6 药材活性成分-靶点-疾病相互作用网络的构建与分析

使用Perl 计算机程序语言编写的脚本，在得到的药物-疾病对应的数据基础上生成药物和疾病的连线和有效化学成分，使用Cytoscape3.7.2 作图，显示出药物-化学成分-靶标的互作网络，并进行分析。提取网络中的交集部分，即为五种药材治疗脾气虚的关键靶点。

2.7 GO 富集分析

为了进一步分析五种药材所调控的生物学过程，将交集蛋白上传至DAVID 数据库（https：//david.ncifcrf.gov/），进行基因本体（Gene ontology，GO）分析，分别得到人参、红参、黑参、西洋参和人参叶所涉及的生物学过程，并对所得数据结果进行可视化分析。

2.8 KEGG 通路富集分析

将前面几步所得到的数据进行整理，通过R 语言和Perl 语言作图，比对有效基因及蛋白，并作出信号通路图，整理归类得出结论，并将所得数据结果进行可视化呈现。

3 结果

3.1 药材有效成分及靶点信息的汇总分析

通过检索中药成分数据库（TCMSP）以及查阅相关文献，收集到不同药材的有效成分及作用靶标，其中人参的有效成分有79 个，红参30 个，黑参17 个，西洋参27 个，人参叶27 个；与各药材相关的靶点分别为人参671 个，红参336 个，黑参176 个，西洋参291 个，人参叶258 个。表1 列出了各药材中作用靶点数居于前十的成分信息。

表1 各药物成分及靶点信息

3.2 五种药材与脾气虚疾病的交集靶点

将3.1 项下得到的五种药材作用靶点分别与脾气虚疾病靶点做交集得到靶点交集的韦恩图，详见图2。人参与肠炎疾病的交集靶点共有537 个，红参有279 个，黑参有157 个，西洋参有235 个，人参叶有208 个。根据得到的交集靶点可进一步进行靶点的蛋白互作网络分析，探究其中的关键靶点与关键活性成分。

图2 五种药材与肠炎的交集靶点韦恩图

3.3 治疗脾气虚相关靶点的PPI 网络分析

利用SRTING 数据库，对五种药材治疗脾气虚的作用靶点间的相互关系进行预测，选取综合打分值大于0.9 的靶点，隐藏游离节点，构建人参、红参、黑参、西洋参和人参叶治疗脾气虚的PPI 网络，如图3 所示。其中MAPK1、STAT3、HSP90AA1、SRC、VEGFA、EGFR 在五种药物的PPI 网络中都具有很高的Degree 排名，可能为人参、红参、黑参、人参叶、西洋参治疗脾气虚的关键靶点。

图3 五种药材活性成分作用靶点的核心PPI 图

3.4 各药材治疗脾气虚的药效物质基础

通过构建药物-疾病-化合物-靶点网络图（图4）得出，人参治疗脾气虚的化合物一共有78 个，与疾病相关的靶点有537 个；红参治疗脾气虚的化合物一共有26 个，与疾病相关的靶点有279 个；黑参治疗脾气虚的化合物一共有16 个，与疾病相关的靶点有157个，西洋参治疗脾气虚的化合物一共有27 个，与疾病相关的靶点有236 个；人参叶治疗脾气虚的化合物一共有26 个，与疾病相关的靶点有216 个。根据分析网络节点并获取对应拓扑度值（Degree），选取Degree 大于等于10 的化合物与靶点作为药物活性成分以及潜在关键靶点（见表2）。

表2 各药材治疗肠炎有效成分Degree 值

图4 五种药材的有效成分与肠炎靶点网络图

3.5 各药材治疗肠炎靶点的GO 富集分析

通过对五种药材作用靶点的GO 富集分析发现，人参有117 个生物学功能，与治疗肠炎关系密切的主要有nuclear receptor activity、ligand -activated transcription factor activity 与steroid hormone receptor activity 等；红参有102 个生物学功能，与治疗肠炎关系密切的主要有protein serine/threonine kinase activity、steroid hormone receptor activity 与nuclear receptor activity 等；黑参有78 个生物学功能，与治疗肠炎关系密切的主要有protein serine/threonine kinase activity、nuclear receptor activity 与ligand-activated transcription factor activity 等；西洋参有25 个生物学功能，与治疗肠炎关系密切的主要有DNA-binding transcription factor binding、transcription coregulator binding 与ltranscription coactivator binding 等；人参叶有19 个生物学功能，与治疗肠炎关系密切的主要有iron ion binding、steroid hydroxylase activity 与monooxygenase activity 等。

3.6 各药材治疗肠炎靶点KEGG 通路富集分析

通过对五种药材的作用靶点进行KEGG 富集分析发现，人参有195 条作用通路，其中与治疗肠炎相关的信号通路主要有PI3K-Akt signaling pathway、Proteoglycans in cancer、Alzheimer disease 等；红参有158 条通路，与治疗肠炎相关的通路主要有Neuroactive ligand -receptor interaction、PI3K -Akt signaling pathway 与Lipid and atherosclerosis 等；黑参有149 条通路，与治疗肠炎相关的通路主要有Neuroactive ligand-receptor interaction、PI3K -Akt signaling pathway与Calcium signaling pathway 等；西洋参有168 条通路，与治疗肠炎相关的通路主要有Neuroactive ligand-receptor interaction、Chemical carcinogenesis-receptor activationr 与PI3K-Akt signaling pathway 等；人参叶有162 条通路，与治疗肠炎相关的通路主要有PI3K-Akt signaling pathway、Proteoglycans in cancer及Chemical carcinogenesis -receptor activation 等。选取显著性最高的前30 条通路，进行可视化分析，详见图5。其中P 值代表富集的显著性，颜色越红则显著性越高，点的大小对应于条目中注释的基因数。

图5 五种药材治疗肠炎靶点的KEGG 通路富集分析图

4 讨论与结论

中药具有多成分、多靶点的特点，因此中药的作用机制一直是研究的热点和难点。因为网络药理学能够反映出药物成分间的协同作用，所以成为研究中药作用机制的得力工具。有鉴于此，本研究通过网络药理学的方法探究人参、红参、黑参、西洋参、人参叶治疗脾气虚的物质基础与作用机制。

通过KEGG 通路富集筛选，人参可通过Neuroactive ligand-receptor interaction（神经活性配体-受体相互作用）、PI3K-Akt signaling pathway（PI3K-Akt 信号通路）、Lipid and atherosclerosis（脂质与动脉粥样硬化）、MAPK signaling pathway（MAPK 信号通路）等195 条通路治疗脾气虚。红参可通过Neuroactive ligand-receptor interaction（神经活性配体-受体相互作用）、PI3K-Akt signaling pathway（PI3K-Akt 信号通路）、cAMP signaling pathway（cAMP 信号通路）等158条通路治疗脾气虚。黑参可通过PI3K-Akt signaling pathway（PI3K-Akt 信号通路）、Proteoglycans in cancer（癌症中的蛋白聚糖）、Alzheimer disease（阿尔茨海默病）等149 条通路治疗脾气虚。西洋参可通过Neuroactive ligand-receptor interaction（神经活性配体-受体相互作用）、Chemical carcinogenesis-receptor activation（化学致癌-受体激活）、PI3K-Akt signaling pathway（PI3K-Akt 信号通路）等168 条通路治疗脾气虚。人参叶可通过PI3K-Akt signaling pathway（PI3KAkt 信号通路）、Proteoglycans in cancer（癌症中的蛋白聚糖）、Chemical carcinogenesis-receptor activation（化学致癌-受体激活）、Alzheimer disease（阿尔茨海默病）等162 条通路治疗脾气虚。根据已有文献报道，Neuroactive ligand-receptor interaction（神经活性配体-受体相互作用）信号通路是质膜上所有与细胞内外信号通路相关的配体和受体的集合[4]。免疫系统发生异常会引起多种疾病，例如自身免疫病、慢性炎症性疾病等。炎症是一种机体应对外界感染、组织损伤及其他细胞应激的反应，炎症反应发生时会引起多条信号通路的激活。研究表明[5]PI3K 信号通路广泛存在于各种神经细胞中，能够激活或者抑制细胞内各种蛋白的磷酸化，调控神经元的存活或者凋亡、自噬、神经元增殖分化以及突触可塑性等过程，例如神经退行性疾病阿尔茨海默病。STAT3 信号通路作为一条与炎症、免疫等相关的信号转导途径，是多种中药的作用靶点[6,7]。马翠翠[8]等发现STAT3 能够诱导炎症反应，这与肿瘤恶病质的发生有关，巨噬细胞可激活STAT3途径，产生炎性细胞因子和不同的巨噬细胞表型，在肿瘤细胞生长、增殖和凋亡等过程中起重要作用，在多数肿瘤中STAT3 信号通路处于持续激活状态，这为治疗肿瘤提供新的靶点。

脾为后天之本，气血生化之源，人参、红参、黑参、西洋参与人参叶皆属于补气类中药。本研究基于网络药理学的方法，对人参、红参、黑参、西洋参和人参叶治疗脾气虚的作用机制进行了探究，这五种药材可能通过调配神经系统、抑制细胞分裂周期、控制炎症反应等方面，发挥多靶点、多通路治疗脾气虚的作用。阐明五种药材治疗脾气虚的作用机制，为五种药材进一步的开发与利用提供理论依据。但现阶段网络药理学仍存在很多不足之处，比如数据库靶点信息的准确性和全面性有待提高；数据库之间药物成分及其靶点的相关性较低，应加强主要数据库之间的整合；蛋白质-蛋白质相互作用关系网络有待进一步完善；网站的稳定性仍有待加强等等，这就使研究结果可能存在一定的偏差性，所以还需要进一步完善各数据库。随着网络药理学和生物系统信息学技术的不断发展，利用网络药理学研究中药的有效成分，探索中药治疗疾病的作用机制，更好的发挥中药在疾病治疗中的作用，使中医药在国际上的影响力不断加强。网络药理学在中药复方的作用机制及其物质基础研究中的深入开展和合理应用值得期待。