苦参醇F对溃疡性结肠炎小鼠的干预作用Δ

何旭东，倪皓雨，何金彪，李敏，胡蕴铠，龚弟鸿，姚金铃，俞捷 ，杨兴鑫 （云南中医药大学中药学院，昆明 650500）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种以结肠黏膜连续性炎症累积为特征的炎症性肠病，以血性腹泻为主要临床症状，还包括腹痛、便血、体重减轻、里急后重、呕吐等其他症状[1]，严重影响患者的生活质量。目前，UC的主要治疗药物是抗炎药物和免疫调节药物，这些药物虽可缓解UC症状，但长期服用会导致患者皮肤坏死、血小板减少、造血功能抑制等[2]。因此，有必要寻找新的UC治疗策略。

研究表明，抑制炎症反应、促进肠道黏膜愈合可有效缓解UC[3]。苦参醇F（kushenol F，KSC-F；结构式见图1）是中药苦参的特征性成分，属异戊烯基黄酮类，有抗菌、抗肿瘤、抗炎等药理活性[4]，具有良好的开发前景。研究表明，10 mg/kg的KSC-F可通过降低核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的磷酸化水平以及NF-κB抑制因子激酶（inhibitor of NF-κB kinase，IKK）和白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6的mRNA表达水平来抑制炎症反应，从而缓解炎症相关症状[5]。UC属于慢性炎症性肠道疾病，炎症反应是其发展和恶化的重要机制之一，抑制炎症反应、减轻炎症损伤是治疗UC的关键，但KSC-F能否通过抑制结肠炎症相关蛋白的表达来抑制炎症反应，进而发挥抗UC作用尚不清楚。为此，本研究拟初步探究KSC-F对UC的干预作用，以期为UC治疗新药的先导化合物的开发提供参考。

图1 KSC-F的结构式

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器包括SpectraMax®Plus 384型光吸收酶标仪（美国Molecular Devices公司），Eclipse E100型正置光学显微镜、Nikon DS-Ri1-U3型数码显微成像系统（日本Nikon公司），LightCycler®96型实时荧光定量（PCR）仪购自瑞士Roche公司，ChemiDoc XRS型化学发光成像系统[赛默飞世尔（中国）科技有限公司]，RM2016型病理切片机（上海徕卡仪器有限公司），JB-P5型组织包埋机（武汉俊杰电子有限公司），KD-P型组织摊片机（浙江省金华市科迪仪器设备有限公司），Milli-Q型超纯水系统（美国Millipore公司）等。

1.2 主要药品与试剂

KSC-F对照品（货号JOT-10801，纯度＞98%）购自成都普菲德生物技术有限公司；柳氮磺吡啶肠溶片（批号09221203，规格0.25 g）购自上海信谊天平药业有限公司；葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS；货号160110）产自美国MP Biomedicals公司，购自广州亿宁生物技术有限公司；IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶联免疫吸附测定（ELISA）检测试剂盒均购自江苏酶联生物科技有限公司；兔源IL-1β、叉头框蛋白O1（forkhead box O1，FOXO1）、磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）、p38促分裂原活化的蛋白激酶（p38 mitogenactivated protein kinase，p38 MAPK）、磷酸化p38 MAPK（phosphorylated p38 MAPK，p-p38 MAPK）、磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p-Akt）、β-肌动蛋白（β-actin）抗体（货号分别为26048-4-AP、18592-1-AP、20584-1-AP、14064-1-AP、28796-1-AP、66444-1-lg、20536-1-AP）均购自美国Proteintech公司；兔源磷酸化PI3K（phosphorylated PI3K，p-PI3K）抗体（货号17366S）购自美国Cell Signaling Technology公司；蛋白定量试剂盒（BCA法）、RIPA裂解缓冲液购自上海碧云天生物技术股份有限公司；环保型脱蜡液、通用型组织固定液、苏木精-伊红（HE）染液套装均购自武汉塞维尔生物科技有限公司；实时聚合酶链反应（real-time PCR，RT-PCR）检测试剂盒购自赛默飞世尔（中国）科技有限公司；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜、5%脱脂奶粉、10×电转液、10×TBST缓冲液、5×Tris甘氨酸-电泳缓冲液均购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3 实验动物

SPF级雄性C57BL/6J小鼠，体重20～22 g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，动物生产许可证号为SCXK（京）2019-0010。所有动物均饲养于温度18～22 ℃、相对湿度50%～60%、每12 h光明/黑暗交替的环境下，自由摄食、饮水，经适应性喂养1周后进行后续实验。本研究方案经云南中医药大学动物实验伦理审查委员会审批，批件号为R-062023111。

2 方法

2.1 分组、造模与给药

将30只小鼠随机分为5组，分别为正常组、模型组、阳性对照组、KSC-F 50 mg/kg组（KSC-F50组）、KSC-F 100 mg/kg组（KSC-F100组），每组6只。除正常组小鼠饮用水外，其余各组小鼠均饮用3%DSS水溶液，连续7 d；与此同时，KSC-F50、KSC-F100组小鼠分别灌胃KSCF 50、100 mg/kg，阳性对照组小鼠灌胃柳氮磺吡啶703 mg/kg，正常组和模型组小鼠灌胃等体积生理盐水，每天1次，连续10 d。KSC-F的剂量参考Jo等[5]的研究；柳氮磺吡啶的剂量则根据成人（体重70 kg）临床剂量换算而得；所有灌胃药液均以N，N-二甲基乙酰胺（2.5%）+吐温80（2.5%）+生理盐水（95.0%）的混合溶液为溶剂。

2.2 一般情况观察及疾病活动指数计算

实验期间，于每天给药前称定并记录各组小鼠体重，观察其粪便排泄情况。于末次给药后、采样前，参照相关文献方法[6]计算各组大鼠的疾病活动指数（disease activity index，DAI），DAI＝（体重减少比例评分+粪便出血评分+粪便硬度评分）/3。各项具体评分标准如表1所示，DAI评分＞0.5表明UC模型复制成功[6]。

表1 DAI评分标准

2.3 样本采集

末次给药后，各组小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠（50 mg/kg）进行麻醉，于眼眶取血，血样在室温下放置1 h后，在4 ℃下以3 000 r/min离心15 min，分离上层血清，备用。取血后，各组小鼠以颈椎脱位法处死，打开腹腔，完整取出其结肠组织，测量结肠长度后，部分结肠组织用4%多聚甲醛溶液固定，用于病理形态观察；另一部分结肠组织于－80 ℃下保存，用于后续指标检测。

2.4 结肠组织病理形态观察

取“2.3”项下固定的各组小鼠结肠组织适量，经乙醇逐级脱水、二甲苯透明后，行常规石蜡包埋、切片。切片烘干后行脱蜡及乙醇脱水处理，再依次用苏木精、伊红染液染色，经二甲苯透明后，以中性树胶封片，使用光学显微镜进行病理形态观察及图像采集。

2.5 血清及结肠组织中炎症因子水平检测

取“2.3”项下各组小鼠血清样品适量，按相应试剂盒说明书方法操作，以酶标仪检测血清中IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α水平。取“2.3”项下各组小鼠冻存的结肠组织适量，加入磷酸盐缓冲液（pH7.4），匀浆，于4 ℃下以12 000 r/min离心15 min，收集上清液，以BCA法定量后，按相应试剂盒说明书方法操作，以酶标仪检测结肠组织中IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17、TNF-α水平。

2.6 结肠组织中炎症因子mRNA表达水平检测

采用RT-PCR法检测。取“2.3”项下冻存的正常组、模型组、KSC-F50组、KSC-F100组小鼠结肠组织各适量，利用Trizol试剂提取其总RNA并逆转录为cDNA，再以所得cDNA为模板进行PCR扩增。总反应体积为20 μL，包括SYBR Premix Ex TaqⅡ（9 μL）、上游引物（0.3 μL）、下游引物（0.3 μL）、cDNA模板（2 μL）和ddH2O（8.4 μL）。反应条件如下：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，62 ℃退火和延伸20 s，共40个循环。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参，采用2－ΔΔCt法计算目的基因mRNA的表达水平。各目的基因PCR扩增的引物序列和产物长度见表2。

表2 各目的基因PCR扩增的引物序列和产物长度

2.7 结肠组织中炎症相关蛋白表达水平检测

采用Western blot法检测。取“2.3”项下冻存的正常组、模型组、KSC-F50组、KSC-F100组小鼠结肠组织各适量，加入RIPA裂解液，于4 ℃下研磨后，再于冰上放置30 min，以3 500 r/min离心15 min，收集上清液，以BCA法定量后作变性处理。取变性后的蛋白样品适量，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转至PVDF膜上，以5%脱脂奶粉封闭；洗膜后，加入IL-1β、FOXO1、PI3K、p-PI3K、p38 MAPK、p-p38 MAPK、p-Akt、β-actin一抗（稀释比例均为1∶1 000），于4 ℃下孵育过夜；洗膜后，加入相应二抗（稀释比例为1∶5 000），室温孵育2 h；洗膜3次，利用化学发光酶标底物显色后，置于化学发光成像系统下成像。以β-actin为内参，使用Image J软件分析各目的蛋白的条带灰度值，以目的蛋白与内参的灰度值比值表示目的蛋白的表达水平。

2.8 统计学方法

采用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析。数据均以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。

3 结果

3.1 KSC-F对UC小鼠一般情况及结肠组织病理形态的影响

在饮用DSS水溶液后，模型组小鼠的体重整体呈下降趋势，DAI评分较正常组显著升高（P＜0.01）且超过0.5；结肠较正常组显著缩短（P＜0.01），结肠组织的隐窝结构大量受损，杯状细胞明显减少，炎症细胞浸润严重。经药物干预后，各药物组小鼠体重减轻的情况有所改善，DAI评分均较模型组显著降低（P＜0.01）；同时，小鼠结肠均较模型组显著延长（P＜0.01），结肠组织的隐窝结构形态得到明显改善，且可见大量杯状细胞，炎症细胞浸润情况亦有所减轻。结果见图2。

图2 KSC-F对UC小鼠一般情况及结肠组织病理形态的影响

3.2 KSC-F对UC小鼠血清及结肠组织中炎症因子水平的影响

与正常组比较，模型组小鼠血清促炎因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平均显著升高（P＜0.01），抗炎因子IL-10虽有下降但差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型组比较，各药物组血清IL-1β、IL-6（KSC-F50组除外）、IL-8、TNF-α水平均显著降低，IL-10水平均显著升高（P＜0.05或P＜0.01）。结果见图3。

图3 KSC-F对UC小鼠血清炎症因子水平的影响（±s，n＝6）

与正常组比较，模型组小鼠结肠组织中促炎因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17、TNF-α水平均显著升高（P＜0.05或P＜0.01），抗炎因子IL-10虽有下降但差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型组比较，各药物组小鼠结肠组织中IL-1β（阳性对照组除外）、IL-6、IL-17、TNF-α（阳性对照组、KSC-F100组除外）水平均显著降低，IL-10水平（阳性对照组除外）均显著升高（P＜0.05或P＜0.01），IL-8虽有下降但差异均无统计学意义（P＞0.05）。结果见图4。

图4 KSC-F对UC小鼠结肠组织中炎症因子水平的影响（±s，n＝6）

3.3 KSC-F对UC小鼠结肠组织中炎症因子mRNA表达的影响

与正常组比较，模型组小鼠结肠组织中IL-1β、IL-17、TNF-α mRNA的表达水平均显著升高（P＜0.01），IL-6 mRNA虽有升高、IL-10 mRNA虽有下降，但差异均无统计学意义（P＞0.05）。与模型组比较，各药物组小鼠结肠中IL-1β（KSC-F50除外）、IL-17、TNF-α（KSC-F50除外）mRNA的表达水平均显著降低（P＜0.01），IL-6、IL-10 mRNA的表达虽有回调但差异均无统计学意义（P＞0.05）。结果见图5。

图5 KSC-F对UC小鼠结肠组织中炎症因子mRNA表达的影响（±s，n＝6）

3.4 KSC-F对UC小鼠结肠组织中炎症相关蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组小鼠结肠组织IL-1β、p-Akt、PI3K、p-PI3K、p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白的表达水平虽有升高，FOXO1蛋白的表达水平虽有降低，但差异均无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，KSC-F100组小鼠结肠组织中p-Akt、p-PI3K、p-p38 MAPK蛋白的表达水平均显著降低，FOXO1蛋白的表达水平显著升高（P＜0.05或P＜0.01）。结果见图6。

图6 KSC-F对UC小鼠结肠组织中炎症相关蛋白表达的影响

4 讨论

UC的典型临床症状包括大便出血、腹泻和体重减轻[1]。目前，UC的发病原因尚不明确，但可能与自身免疫、遗传、感染和过敏等因素有关[2]。UC的病理特征为存在于结肠黏膜至直肠近端的持续性、弥散性炎症[7]。此外，在发病过程中，PI3K/Akt信号通路及FOXO-1、IL-1β、p38 MAPK蛋白被激活，进而促进中性粒细胞和巨噬细胞释放炎症因子，引发炎症反应；炎症反应又导致结肠黏膜血管扩张、血管通透性增加，血液和免疫细胞渗入组织间隙，从而引起组织水肿、纤维化和溃疡形成[8-11]。可见，控制炎症反应、减轻炎症损伤是治疗UC的关键。柳氮磺吡啶是临床治疗UC的常用药物，其抗炎活性确切，故被选作本研究的阳性对照药物。

在结肠炎症中，促炎因子TNF-α上调会破坏结肠上皮屏障，促进IL-6、IL-1β产生；与此同时，作为抗炎因子的IL-10则可维持胃肠道稳态[12]。KSC-F是从苦参中发现的一种异戊烯基黄酮类成分，已被证实具有抗肿瘤、抗菌、抗炎等药理活性[4-5]。本研究结果显示，50、100 mg/kg的KSC-F可改善UC小鼠体重减轻的情况，显著降低DAI评分，显著增加结肠长度及结肠组织中杯状细胞数量，改善隐窝结构形态，减轻炎症细胞浸润，能不同程度地降低模型小鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和结肠组织中IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α水平，以及结肠组织中IL-1β、IL-17、TNF-α mRNA的表达水平，提示KSCF具有改善UC小鼠结肠组织病变和炎症反应的作用。

PI3K的激活可活化Akt，从而促进炎症细胞的激活和炎症因子的产生[8]。此外，活化的Akt可负反馈调节FOXO1的表达，从而进一步增加IL-1β的表达，而IL-1β可进一步激活p38 MAPK，从而加剧炎症反应[13-15]。研究表明，MHY2013可通过抑制Akt和p38 MAPK的激活，增加FOXO1蛋白的表达，抑制IL-1β的转录，从而减轻胰岛素抵抗引起的炎症反应，提示PI3K、Akt、p38 MAPK蛋白的激活与炎症反应的发生发展密切相关[15]。本研究结果显示，在DSS诱导的模型组小鼠中，其结肠组织中IL-1β、p-Akt、PI3K、p-PI3K、p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白的表达虽较正常组有所上升，FOXO1蛋白的表达虽有所下降，但差异均无统计学意义。本课题组推测这些蛋白可能参与了UC的发生发展，但可能并非主要机制，有待进一步验证。本研究结果还显示，50、100 mg/kg的KSC-F能不同程度地下调p-Akt、p-PI3K、pp38 MAPK蛋白的表达，同时上调FOXO1蛋白的表达，提示KSC-F可通过抑制PI3K、Akt、p38 MAPK蛋白的激活，增加FOXO1蛋白的表达来缓解UC小鼠的炎症反应。

柳氮磺吡啶已被广泛应用于UC、克罗恩病和类风湿性关节炎等炎症性疾病的临床治疗，成人用药剂量为57 mg/（kg·d），按成人体重70 kg换算，小鼠给药剂量为703 mg/（kg·d）。本研究结果证实，100 mg/（kg·d）的KSC-F对UC小鼠炎症反应具有明显的抑制作用，且剂量低于阳性对照药，提示KSC-F的临床有效剂量可能更低。

综上所述，KSC-F可通过抑制PI3K、Akt、p38 MAPK蛋白的激活，抑制IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎因子的释放，促进抗炎因子IL-10的分泌，减轻结肠组织炎症损伤，从而改善UC小鼠的相关症状。但KSC-F能否通过影响其他机制（如肠道微生物、体内免疫系统）来发挥抗UC作用仍有待后续研究深入探讨。