2020-2022年华中地区部分猪场猪圆环病毒3型的分子流行特征与遗传变异分析

李博天，李春琪，刘国平，谢军，曾攀，赵润泽，李桐，裴洁，郭利伟，伍锐，谭磊

2020-2022年华中地区部分猪场猪圆环病毒3型的分子流行特征与遗传变异分析

1长江大学动物科学技术学院，湖北荆州 434020；2湖北省动物疫病预防控制中心，武汉 430000；3四川农业大学动物医学院，成都 610000

【目的】通过系统性试验方案摸清我国华中部分地区猪圆环病毒3型（porcine circovirus 3）流行病学及遗传变异特点，为PCV3疫苗研究提供数据基础。【方法】对华中地区（湖北、湖南和河南）15个规模化养猪场的3 500份临床采集样品进行real-time PCR检测，分析不同猪群、不同组织器官、不同排毒量和对应流行病学症状特点关系。对部分阳性样本PCV3全基因组进行扩增、测序和分析。【结果】50.86%（1 780/3 500）被检样本为PCV3核酸阳性，不同发育阶段猪群PCV3均易感，保育猪、哺乳仔猪、生长育肥猪PCV3阳性率较高，分别为70.44%（498/707）、67.19%（596/887）、41.75%（177/424）。在不同组织器官和样品中，淋巴结、肺脏、产后胎盘样本PCV3阳性率为67.05%（59/88）、63.79%（74/116）、49.11%（55/112），血液、初乳样本PCV3阳性率分别为56.09%（502/895）、44.20%（278/629），且鼻拭子和唾液中均检出PCV3。出现猪繁殖障碍症状、厌食症状和呼吸障碍症状的猪群PCV3阳性率高，分别为44.43%（399/898）、36.43%（431/1183）、28.04%(233/831)。24条PCV3全基因组序列长度均为2000 nt，其全基因核苷酸序列同源性为98.4%—100%，与参考株PCV3全基因组的同源性为97.4%—99.5%。遗传进化分析结果显示，23株PCV3属于PCV3b亚型，1株属于PCV3a亚型。Rep氨基酸序列比对结果发现，PCV3-L2、L23和L14株分别在（N124I)、（A183E）和(V244I)出现独特变异位点；Cap蛋白氨基酸序列比对结果发现，PCV3-L15、L21、L3和L19株分别在(T45P)、（R2K)、（R14K)和（F7L）出现独特变异位点。【结论】PCV3可感染不同发育阶段猪群，且分布于不同组织器官中；PCV3可通过垂直传播（如初乳和精液）和水平传播（如口鼻分泌物和唾液）感染猪群；PCV3感染可能与生猪繁殖障碍、呼吸障碍和多器官炎症和关节炎症密切相关。此外，被调查地区规模化猪场同时流行PCV3a和PCV3b两种亚型，其中PCV3b亚型为优势毒株。研究通过全基因组氨基酸序列分析发现部分独特变异位点位于Cap蛋白，这可能导致Cap蛋白赋予的免疫原性发生变化。对PCV3全基因序列的遗传进化做出详细阐述，为未来的PCV3疫苗研究奠定基础。

猪圆环病毒3型；病毒载量；全基因组扩增；遗传进化分析

0 引言

【研究意义】近些年来，猪圆环病毒3型（porcine circovirus 3，PCV3）的出现给我国的生猪产业发展带来巨大压力，对我国现代化猪场的生产和疾病的防控提出了更高的要求，了解PCV3流行特征和流行率以及PCV3遗传变异情况，对PCV3的防控具有重大意义。【前人研究进展】其中，2016年，美国堪萨斯州立大学的研究人员于2016年从患有猪皮炎肾病综合征（porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS）的患病母猪和其流产胎儿中首次分离并鉴定出新型的猪圆环病毒[1]，该病毒基因组比猪圆环病毒1型（porcine circovirus 1， PCV1）和猪圆环病毒2型（porcine circovirus 2， PCV2）的基因组大，并且与PCV2的基因组相似度低，只有37%，依据病毒分类原则，被判定为一种新的基因型，并命名为PCV3[2]；之后PCV3在韩国、丹麦、巴西、泰国和西班牙等地方均有相关报道[3]。我国关于PCV3的首次报道是在2017年，通过溯源发现该病毒早在2015年就在我国猪场内传播[4]。截至2023年4月，我国已经有26个省份报道存在PCV3感染的情况，且阳性率呈不断上升的趋势，多以继发混合感染为主[5-7]，感染引发仔猪腹泻、断奶仔猪多系统衰竭和母猪繁殖障碍等疾病[8]，给养殖场造成了重大的经济损失。猪和野猪是PCV3感染的主要宿主，但在牛、犬、狗、鼠、蜱等动物体内也可以检测到PCV3基因组的存在[9-11]。PCV3可以垂直传播，各种日龄的猪只均易感染[12]，且推测其PCV3感染与PDNS等疾病有密切关联[13]。【本研究切入点】PCV3的全基因组全长为2 000 nt，包含3个开放框[14]，ORF1编码复制相关蛋白及一种特殊的启动子（非ATG），被认为最保守的区域[15]。研究发现，Rep蛋白与其他哺乳动物圆环病毒亲缘关系密切，而与禽类圆环病毒亲缘关系较远[16]，说明PCV3的Rep蛋白可能起源于哺乳动物。ORF2编码衣壳蛋白，位于ORF2内的功能Cap基因作为PCV3分子流行病学调查的最佳基因，编码PCV3的主要结构蛋白和抗原蛋白[17]，HA等对PCV3进化过程中Cap蛋白主要氨基酸的突变及逆行分析[18]，前期报道临床表现有繁殖障碍的母猪和流产的胎儿样品中的PCV3 Cap序列均存在突变位点；后有报道，PCV3的Cap蛋白的新突变位点K139R、I150F、P169T，可见PCV3的基因组稳定，但也在不断地进化[19]。目前对于ORF3的研究较少[18]，其功能尚不清楚。【拟解决的关键问题】目前，华中地区的PCV3的检出率呈急剧增长趋势，了解华中地区PCV3的流行特征和遗传特征。为华中地区PCV3的免疫防控、疫苗研究和实验室诊断技术提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 2020年1月至2022年12月期间，从华中地区（湖北、湖南和河南）15个规模化养猪场（母猪存栏量＞1 000头）收集了3 500份临床实验样品，系统地采集了猪群的不同阶段，包括经产母猪，头产母猪，保育猪，哺乳仔猪以及生长育肥猪，进行了器官检测，包括心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、淋巴结、胃以及产后胎盘，并对血液、精液、初乳、外阴拭子，肛门拭子，鼻拭子及唾液进行检测，样品置于冰上保存运输至湖北省长江大学重疾预警与净化实验室，并于24 h内完成后续试验。此外通过对PCV3的流行率和流行特征进行了研究，跟踪检测了疑似临床症状包括厌食症的猪群，咳喘，跛腿和流产、早产、产木乃伊胎等有生殖障碍的母猪以及发红的仔猪，检测出的阳性样本用本实验设计的扩增引物扩增，紫外凝胶成像仪中观察、拍照。阳性条带切胶回收后编号，送往上海生物工程有限公司进行测序。

1.1.2 主要试剂 DL-2000 Marker、2×KeyPo Master Mix (Dye Plus)高保真酶，购自南京诺唯赞有限公司；GeneRed核酸染料、琼脂糖、DNA提取试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司；TB Green Premix ExII（2x）荧光染料、pMD19-T载体、DH5α感受态细胞，均购自TaKaRa公司；LA 固体培养基、氨苄西林，购自OXOID公司。

1.1.3 主要仪器 凝胶电泳仪（型号为Power Pac 300）、全自动紫外凝胶成像系统（型号为Chemi Doc XRS+），荧光定量PCR仪（型号CFX-96），购自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 根据NCBI中PCV3毒株PCV3-US /MO2015（登录号：KX778720.1）基因序列，通过DNAMAN和DNAStar软件进行比对，选择保守区间，使用Primer Premier 5.0以及Oligo 7.0软件设计了3对病毒性特异性引物，和1对检测引物。引物序列信息见（表1），引物由上海生物工程有限公司合成。

1.2.2 PCV3流行病学检测 系统性地对不同猪群、不同器官、不同排毒、对应流行病学症状进行检测。PCV3检测反应总体系为：SYBR GreenII荧光定量PCR反应总体系为 20 μL：TB Green Premix ExII（2x）荧光染料 10 μL；上下游引物各 0.6 μL（10 μmol·L-1）；模板 1.6 μL；用无 RNA 酶水补至 20 μL。PCV3检测反应程序：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 37 s，共40个循环，试验设置空白对照。PCV3的病毒载量：根据检测方法检测病毒，并与其标准曲线结果进行计算，下面的虚线表示临界值（c1＝102copies/mL），上面的虚线表示双重临界值（c2＝104copies/mL）。根据病毒载量的大小，将病毒载量分为低病毒载量（体积≤c1）、中病毒载量（c1<体积≤c2）和高病毒载量（体积＞c2)三个水平。

1.2.3 PCV3全基因组扩增 PCV3扩增反应总体系为50 μL：无 RNA 酶水22 μL，2×KeyPo Master Mix（Dye Plus）高保真酶20 μL，上下游引物（10 μmoL·L-1）各2 μL，DNA模板4 μL。PCV3扩增反应程序：95℃ 10 min；95℃ 20 s，58℃退火70 s，72℃ 1 min，共35个循环；72℃延伸10 min。反应结束后取5 μL扩增产物于10 g·L-1的琼脂糖凝胶中电泳40 min，紫外凝胶成像仪中观察、拍照。阳性条带切胶回收后编号，送上海生物工程有限公司进行测序。

1.2.4 遗传进化分析 将统一编号的不同测序结果通过DNAStar中的SeqMAN软件进行拼接获得全基因组序列，用NCBI的Blast比对分析。选取国内外21株PCV3序列作为参考（表2）。全基因、ORF1及ORF2的核苷酸序列同源性用DNAStar中的MegAlign软件进行比对；系统遗传进化树使用MEGA7生物软件绘制，通过软件中的Clustal W的比对方法进行比对，构建进化树时采用Neighbor- Joining法。

1.2.5 Rep和Cap蛋白氨基酸比对分析 利用EditSeq软件（网址：http://www.editplus.com/html.html）从所获得的PCV3 Rep、Cap蛋白基因序列，将其推导为氨基酸序列和GenBank中已发表的PCV3参考序列进行比对。

表2 PCV3参考株信息

2 结果

2.1 样品病原检测结果流行病学调查

2.1.1 不同猪场PCV3的流行情况 采用real-time PCR对华中地区（湖北、湖南和河南）15个猪场（母猪存栏量＞1 000头）的3 500份临床样品进行检测，结果显示：位于湖北的6个猪场阳性率分别为51.21%、46.93%、48.74%、55.85%、50.47%、63.32%。位于湖南的5个猪场的阳性率分别为63.44%、40.56%、48.08%、57.96%、50.21%。位于河南的4个猪场的阳性率分别为58.03%、50%、54.59%、55.79%（表3）。

表3 阳性样品信息

2.1.2 不同阶段猪群的PCV3检测 采用real-time PCR对3 500份临床样品进行检测，结果显示：在不同阶段的猪群进行检测，哺乳仔猪阳性率为67.19%，保育猪的阳性率为70.44%，生长育肥猪的阳性率为41.75%，经产母猪的阳性率为36.00%，头胎母猪的阳性率为31.15%，种公猪的阳性率为23.36%（表4）。其中，哺乳仔猪的病毒载量最高，其次是保育猪和生长育肥猪，病毒载量也比较高。种公猪的病毒载量最低（图1-A，B）。

表4 阳性样品信息

2.1.3 组织器官中PCV3的检测 采用real-time PCR对949份临床样品进行检测，结果显示：淋巴结、肺脏、产后胎盘、肝脏、肾脏、胃、脾脏、心脏感染PCV3的阳性率分别为67.05%、63.79%、49.11%、42.74%、39.49%、36%、23.81%、22.31%（表5）。其中淋巴结、肺脏和产后胎盘的病毒载量普遍较高，淋巴结、肺脏和产后胎盘的阳性率也偏高。心脏的病毒载量最低，心脏的阳性率也较低（图1-C）。

表5 阳性样品信息

2.1.4 猪群的PCV3排毒情况 用real-time PCR对3 300份临床样品进行检测，结果显示：血液中检出的阳性率为56.09%，初乳中检出的阳性率为44.2%，外阴拭子检出的阳性率为37.63%，精液检出的阳性率为31.31%，唾液检出的阳性率为23.25%，鼻拭子检出的阳性率为25.99%（表6）。其中血液中的病毒载量最高，初乳中的病毒载量仅次于血液中的病毒含量，而鼻拭子和唾液中病毒含量比较低（图1-D）。

表6 阳性样品信息

2.1.5 不同临床症状的猪群PCV3检测 采用real-time PCR对3 207份临床样品进行检测，结果显示：出现少吃、产木乃伊、早产、流产、小猪发红、未吃完、不吃、咳喘、跛腿、死亡和腹泻症状的猪群感染PCV3的阳性率分别为51.99%、50.34%、46.32%、41.51%、32.35%、31.14%、29.75%、28.04%、24.51%、16.67%、4.82%（表7）。其中表现流产、早产症状的猪群PCV3的阳性率和病毒载量均较高，表现死亡症状的猪群PCV3阳性率比较低，但病毒载量较高（图1-E）。

2.2 猪圆环病毒3型病毒检测及全基因组扩增

将拷贝数为1×108—1×100copies/μL的8个稀释度的重组质粒（实验室留存）作为模板，测得荧光定量PCR最低检出限为1×101copies/μL。以猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis of swine，TGEV）、猪细小病毒（porcine parvovirus，PPV）、猪圆环2型病毒（porcine circovirus 2, PCV2）和猪伪狂犬病毒（pseudorabies virus，PRV），基因组DNA为模板，结果显示无其他扩增曲线，特异性良好（图2）。熔解曲线的温度为82℃左右，并呈现单一峰，表明无引物二聚体及非特异性扩增。组内变异系数在0.1%—0.6%，组间变异系数在0.2%— 1.1%，均小于2%，证明该方法重复性良好。标准曲线方程为=-3.818+41.437，2=0.9984。

A：标准曲线；B：不同阶段病毒载量图；C：不同部位病毒载量图；D：不同样本病毒载量图；E：不同症状病毒载量图

表7 阳性样品信息

A：PCV3 qPCR扩增曲线；B：特异性检测结果；C：融解曲线；D：标准曲线

用三对引物对PCV3阳性样品进行全基因组扩增，成功扩增出条带，产物大小与预期片段大小一致（图3），分别为816、419和836 bp。共获得24株PCV3全基因组序列。

M：DL2000 DNA marker；1：P1引物对扩增产物（816 bp）；2：P2引物对扩增产物（419 bp）；3：P3引物对扩增产物（836 bp）；-：阴性对照

2.3 猪圆环病毒3型病毒的遗传进化分析

对获得的24株PCV3样品毒株与国内外上传GenBank中的24株PCV3全基因组序列用MEGA7生物软件绘制系统遗传进化树（图4）。本研究扩增的PCV3全基因组的遗传关系均较近，24株PCV3的ORF2序列在2个小分支均有分布。其中PCV3-L20、PCV3-L9、PCV3-L8等23株与PCV3-BR/RS/8、PCV3/ KU-1605和PCV3-Shandong-01在同一个分支，属于3b毒株分支。PCV3-L21样品毒株与PCV3-BJ-1亲缘关系最近，与PCV3/KU-1601、CN/Liaoning-2017和CN/Fujian-12/2016在同一分支，属于3a毒株分支。根据ORF2遗传进化树，4%的样品毒株为PCV3a亚型，96%的样品毒株为PCV3b亚型，本研究未获得PCV3c亚型样品毒株，表明PCV3b亚型毒株成为华中部分地区主要流行毒株。

A：●本研究获得的PCV3全基因序列；◇GenBank中国外的PCV3全基因序列；B：●本研究获得的PCV3 ORF1序列；◇GenBank中国外的PCV3 ORF1序列；C：●本研究获得的PCV3 ORF2序列；◇GenBank中国外的PCV3 ORF2序列

2.4 猪圆环病毒3型病毒全基因组、ORF1及ORF2序列同源性分析

对24株PCV3样品毒株及国内外上传至GenBank中的24株PCV3全基因组序列用DNAStar软件中的MegAlign软件进行同源性分析。24份样品毒株PCV3全基因组核苷酸序列同源性为98.4%—100%，与国内外的参考株PCV3全基因组的同源性为97.4%— 99.5%。其中样品毒株PCV3-L18与参考株PCV3/KU- 1605的核苷酸序列同源性最高（99.5%），样品毒株PCV3-L11与参考株CN/FuJian-318-2017、参考株CN/FuJian-820-2016的核苷酸序列同源性均为最低（97.4%）。

对24株PCV3样品毒株及国内外上传至GenBank中的24株PCV3 ORF1序列用DNAStar软件中的MegAlign软件进行同源性分析。发现24份样品毒株之间ORF2核苷酸序列同源性为98.9%—100%，与国内外的参考株PCV3 ORF2的同源性为97.6%— 99.8%。其中样品毒株PCV3-L3与CN/FuJian-820-2016同源性最低为（97.6%）,样品毒株PCV3-L6、PCV3-L7、PCV3-L8、PCV3-L9、PCV3-L10、PCV3-L11、PCV3-L12与PCV3/CN/Chongqing-147同源性均为最高（99.8%）。

对24株PCV3样品毒株及国内外上传至GenBank中的24株PCV3 ORF2序列用DNAStar软件中的MegAlign软件进行同源性分析。发现24份样品毒株之间ORF2核苷酸序列同源性为97.7%—100%，与国内外的参考株PCV3 ORF2的同源性为97.1%— 99.2%。其中样品毒株PCV3-L20与参考株CN/FuJian- 820-2016和参考株CN/FuJian-318-2017的核苷酸序列同源性均为最低（97.1%）。

2.5 PCV3 Rep和Cap氨基酸序列比对

本研究获得的24株PCV3样品毒株的ORF1序列编码的Rep蛋白均由297个氨基酸组成。将本研究的24株PCV3 Rep蛋白氨基酸序列在BioEdit中进行分析，结果表明:样品毒株PCV3-L2在（N124I）出现独特变异位点，样品毒株PCV3-L23在（A183E）出现独特变异位点，样品毒株PCV3-L14在(V244I）出现独特变异位点。此外，PCV3/KU-1605参考株在第19位氨基酸位点为C，其他参考株和样品毒株氨基酸位点为P。在第122位,部分PCV3b型参考株氨基酸位点为A，部分PCV3b型参考株氨基酸位点为S（图5）。

本研究获得的24株PCV3样品毒株的ORF2序列编码的Cap蛋白均由214个氨基酸组成。将本研究的24株PCV3 Cap蛋白氨基酸序列在BioEdit中进行分析，结果表明：PCV3b亚型中样品毒株PCV3-L15在（T45P）出现独特变异位点，样品毒株PCV3-L3在（R14K）出现独特变异位点，样品毒株PCV3-L19在（F7L）出现独特变异位点。PCV3a亚型中样品毒株PCV3-L21在（R2K）出现独特变异位点。此外，PCV3a亚型中的毒株序列第24位是丙氨酸（A）和第27位是精氨酸（R）的毒株，而PCV3b亚型中的毒株序列第24位是缬氨酸（V）和第27位是赖氨酸（K）的毒株（图6）。

3 讨论

3.1 流行特征

PCV3感染动物后，可能会引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（postweaning multisystemic wasting syndromePMWS）、猪皮炎与肾病综合征（porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS）、心脏和多系统的炎症、食欲不振、发热、生殖障碍等症状。据研究表明，WANG 等[20]在患有PMWS的猪群中检测出PCV3，但同时还检测出了PCV2，因此PCV3是否能单独引起 PMWS 尚不清楚。PDNS与PCV密切相关，PALINSKI等[1]在患有PDNS的母猪组织中检测到PCV3，患病猪群出现支气管炎、淋巴结肿胀等症状。心脏和多系统炎症：PCV3可引起多种器官和组织的炎症，目前发现的有间质性肺炎、非化脓性心肌炎、弥漫性肉芽肿性淋巴结炎及心脏小动脉炎等[21]。PALINSKI等[1]在患有生殖障碍的母猪中检测到PCV3，随后KU等[22]、TOCHETTO 等[23]均在患有生殖障碍的母猪中检测出PCV3。

本研究结果发现，不同阶段猪群对PCV3均易感，保育猪、哺乳仔猪、育肥猪感染PCV3的阳性率较高，分别为70.44%、67.19%、41.75%，其中哺乳仔猪感染PCV3的病毒载量最高，PCV3对哺乳仔猪的危害较大[23-24]。在不同组织样本中，淋巴结中PCV3的阳性率和病毒载量均最高，这表明PCV3有类似于PCV2的致病机理，产生免疫抑制，导致PCV3与其他病毒混合感染情况比较普遍[25]。初乳样本中感染PCV3的阳性率为44.20%，提示PCV3可通过乳液传播[26]。此外，鼻拭子和唾液中均检出PCV3，说明PCV3可通过口鼻进行传播[26]。PCV3的传播途径较多，且目前暂无有效疫苗，这也是该病防控效果差的主要原因。出现产木乃伊胎、流产、早产等繁殖障碍的猪群感染PCV3的阳性率均较高，分别为50.34%、46.32%、41.51%，并且其PCV3病毒载量也比较高，这进一步提示了PCV3感染可能与妊娠母猪繁殖密切相关[27]。出现咳喘症状和跛腿症状猪群感染PCV3的阳性率分别为28%和24.51%，提示PCV3感染可能与猪群出现呼吸障碍和跛腿症状相关。未来需要进行动物回归试验进一步系统性分析PCV3致病性特征。

图5 24株PCV3毒株与6株参考毒株的Rep蛋白氨基酸序列比对

3.2 遗传变异特征

本研究对24株样品毒株进行PCR扩增与全基因组测序。所得24条PCV3全基因组序列长度均为2 000 nt，24株样品毒株之间的全基因核苷酸序列的同源性为98.4%—100%。根据遗传进化树显示，本研究依据Cap蛋白氨基酸第24位和第27位分型，其中4%样品毒株为PCV3a亚型，96%样品毒株为PCV3b亚型，未获得PCV3c亚型样品毒株，这表明PCV3b亚型正在代替PCV3a亚型成为华中地区的优势毒株[28]。根据核苷酸和氨基酸序列比对分析显示，虽然24株样品毒株与国内外的流行株同源性较高，但仍然存在少量变异位点。基于ORF1序列的Rep蛋白进行氨基酸比对，PCV3-L2、L23和L14株分别在（N124I）、（A183E）和（V244I）出现独特变异位点。此外，PCV3/KU-1605参考株在第19位氨基酸位点为C，其他参考株和样品毒株氨基酸位点为P。在第122位,部分PCV3b型参考株氨基酸位点为A，部分PCV3b型参考株氨基酸位点为S，这可能导致使用Rep蛋白分型不明确的原因。有研究表明，PCV3中的编码Cap蛋白的ORF2区域最容易发生突变，PCV3的疫苗也是围绕Cap蛋白展开的[29-31]。因此，基于ORF2序列进行氨基酸比对，其中Cap蛋白氨基酸序列比对结果发现，PCV3-L15、L21、L3和L19株分别在（T45P）、（R2K）、（R14K）和（F7L）出现独特变异位点，这可能导致Cap蛋白赋予的免疫原性发生变化[31]，但仍需进一步研究这些氨基酸的突变对病毒的影响。本研究中发现的PCV3独特变异位点有利于对国内PCV3的监测。对了解华中部分地区PCV3的遗传多样性提供了科学依据，丰富了华中地区PCV3的流行病学资料。

图6 24株PCV3毒株与6株参考毒株的Cap蛋白氨基酸序列比对

4 结论

通过对2020—2022年间在华中部分地区采集的临床样本进行PCV3的流行病学调查和遗传特征分析，揭示了PCV3感染范围广泛，不仅可以感染不同生长阶段的猪群，并且可以分布在感染猪只的不同组织器官中。PCV3既可通过初乳和精液等进行垂直传播，也可通过口鼻分泌物和唾液等进行水平传播。本研究通过不同临床症状的猪群PCV3检测对猪只感染PCV3可能产生早产、流产等繁殖障碍性症状，咳喘等呼吸道症状，心脏及多器官炎症和关节炎症等提供补充依据。本研究按照Rep蛋白对PCV3病毒分型不太明确。根据Cap蛋白分型，表明PCV3b亚型正在代替PCV3a亚型成为华中部分地区的优势毒株。本研究通过全基因组氨基酸序列分析发现部分独特变异位点位于Cap蛋白，这可能导致Cap蛋白赋予的免疫原性发生变化，可能使病毒的毒力特征发生改变。本研究对PCV3全基因序列的遗传进化做出详细阐述，为PCV3疫苗研究提供理论依据。

[1] PALINSKI R, PIÑEYRO P, SHANG P C, YUAN F F, GUO R, FANG Y, BYERS E, HAUSE B M. A novel porcine circovirus distantly related to known circoviruses is associated with porcine dermatitis and nephropathy syndrome and reproductive failure. Journal of Virology, 2017, 91(1): e01879-e01816.

[2] ALLAN G M, PHENIX K V, TODD D, MCNULTY M S. Some biological and physico-chemical properties of porcine circovirus. Zentralblatt Fur Veterinarmedizin Reihe B Journal of Veterinary Medicine Series B, 1994, 41(1): 17-26.

[3] KWON T, YOO S J, PARK C K, LYOO Y S. Prevalence of novel porcine circovirus 3 in Korean pig populations. Veterinary Microbiology, 2017, 207: 178-180.

[4] QI S S, SU M J, GUO D H, LI C Q, WEI S, FENG L, SUN D B. Molecular detection and phylogenetic analysis of porcine circovirus type 3 in 21 Provinces of China during 2015-2017. Transboundary and Emerging Diseases, 2019, 66(2): 1004-1015.

[5] 张建武, 庄金山, 袁世山. 中国部分地区高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子流行病学研究. 中国农业科学, 2008, 41(6): 1822-1831.

ZHANG J W, ZHUANG J S, YUAN S S. Molecular epidemiology study on high pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus in some regions of China. Scientia Agricultura Sinica, 2008, 41(6): 1822-1831. (in Chinese)

[6] 贾慧茹, 吴艳艳, 王强, 代平礼, 周婷. 2014—2015年中国部分地区蜜蜂慢性麻痹病病毒流行病学调查及系统发育分析. 中国农业科学, 2016, 49(10): 2017-2026.doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016. 10.016.

JIA H R, WU Y Y, WANG Q, DAI P L, ZHOU T. Epidemiological survey and molecular phylogenetic analysis of chronic bee paralysis virus in China from 2014 to 2015. Scientia Agricultura Sinica, 2016, 49(10): 2017-2026. doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.10.016.(in Chinese)

[7] 周群, 陈小飞, 阚蕊慈, 李玉, 曹慧, 彭艳伶, 张斌. 2017—2019年四川地区猪A群轮状病毒的分子流行病学调查. 中国农业科学, 2021, 54(5): 1063-1072.doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2021.05.016.

ZHOU Q, CHEN X F, KAN R C, LI Y, CAO H, PENG Y L, ZHANG B. Molecular epidemiological investigation of porcine group A rotavirus in Sichuan from 2017 to 2019. Scientia Agricultura Sinica, 2021, 54(5): 1063-1072. doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2021.05.016.(in Chinese)

[8] WANG W, SUN W C, CAO L, ZHENG M, ZHU Y L, LI W J, LIU C X, ZHUANG X Y, XING J L, LU H J, LUO T R, JIN N Y. An epidemiological investigation of porcine circovirus 3 infection in cattle in Shandong Province, China. BMC Veterinary Research, 2019, 15(1): 60.

[9] JIANG S C, ZHOU N N, LI Y F, AN J H, CHANG T H. Detection and sequencing of porcine circovirus 3 in commercially sourced laboratory mice. Veterinary Medicine and Science, 2019, 5(2): 176-181.

[10] FRANZO G, GRASSI L, TUCCIARONE C M, DRIGO M, MARTINI M, PASOTTO D, MONDIN A, MENANDRO M L. A wild circulation: High presence of Porcine circovirus 3 in different mammalian wild hosts and ticks. Transboundary and Emerging Diseases, 2019, 66(4): 1548-1557.

[11] OUYANG T, NIU G Y, LIU X H, ZHANG X W, ZHANG Y, REN L Z. Recent progress on porcine circovirus type 3. Infection, Genetics and Evolution, 2019, 73: 227-233.

[12] BERA B C, CHOUDHARY M, ANAND T, VIRMANI N, SUNDARAM K, CHOUDHARY B, TRIPATHI B N. Detection and genetic characterization of porcine circovirus 3 (PCV3) in pigs in India. Transboundary and Emerging Diseases, 2020, 67(3): 1062-1067.

[13] PATTERSON A R, MADSON D M, HALBUR P G, OPRIESSNIG T. Shedding and infection dynamics of porcine circovirus type 2 (PCV2) after natural exposure. Veterinary Microbiology, 2011, 149(1/2): 225-229.

[14] 张爱琼. PCV3贵州流行株基因组分析及其Cap蛋白的原核表达研究[D]. 贵阳: 贵州大学, 2019.

ZHANG A Q. Genomic analysis of PCV3epidemic strains in Guizhou and prokaryotic expression of cap protein[D]. Guiyang: Guizhou University, 2019. (in Chinese)

[15] 王承玉. 猪圆环病毒3型重组质粒的构建与遗传进化分析[D]. 保定: 河北农业大学, 2020.

WANG C Y. Recombinant plasmid construction of porcine circovirus type 3 and genetic evolution analysis[D]. Baoding: Hebei Agricultural University, 2020. (in Chinese)

[16] FRANZO G, SEGALES J, TUCCIARONE C M, CECCHINATO M, DRIGO M. The analysis of genome composition and codon bias reveals distinctive patterns between avian and mammalian circoviruses which suggest a potential recombinant origin for Porcine circovirus 3. PLoS ONE, 2018, 13(6): e0199950.

[17] SONG Y F, JIN M L, ZHANG S L, XU X J, XIAO S B, CAO S B, CHEN H C. Generation and immunogenicity of a recombinant pseudorabies virus expressing cap protein of porcine circovirus type 2. Veterinary Microbiology, 2007, 119(2/3/4): 97-104.

[18] HA Z, LI J F, XIE C Z, YU C D, HAO P F, ZHANG Y, XU W, NAN F L, XIE Y B, LI Y W, RONG F L, WANG G Y, GUO Y C, LU H J, JIN N Y. Prevalence, pathogenesis, and evolution of porcine circovirus type 3 in China from 2016 to 2019. Veterinary Microbiology, 2020, 247: 108756.

[19] LI L L, KAPOOR A, SLIKAS B, BAMIDELE O S, WANG C L, SHAUKAT S, MASROOR M A, WILSON M L, NDJANGO J B N, PEETERS M, GROSS-CAMP N D, MULLER M N, HAHN B H, WOLFE N D, TRIKI H, BARTKUS J, ZAIDI S Z, DELWART E. Multiple diverse circoviruses infect farm animals and are commonly found in human and chimpanzee feces. Journal of Virology, 2010, 84(4): 1674-1682.

[20] WANG J C, ZHANG Y N, WANG J F, LIU L B, PANG X Y, YUAN W Z. Development of a TaqMan-based real-time PCR assay for the specific detection of porcine circovirus 3. Journal of Virological Methods, 2017, 248: 177-180.

[21] 刘相聪. 华南地区猪圆环病毒3型的流行病学调查及ELISA检测方法的建立[D]. 广州: 华南农业大学, 2018.

LIU X C. Prevalence of porcine circovirus type 3 in South China and development of an indirect ELISA for antibody detection[D]. Guangzhou: South China Agricultural University, 2018. (in Chinese)

[22] KU X, CHEN F, LI P, WANG Y, YU X, FAN S, QIAN P, WU M, HE Q. Identification and genetic characterization of porcine circovirus type 3 in China. Transboundary and Emerging Diseases, 2017, 64(3): 703-708.

[23] TOCHETTO C, LIMA D A, VARELA A P M, LOIKO M R, PAIM W P, SCHEFFER C M, HERPICH J I, CERVA C, SCHMITD C, CIBULSKI S P, SANTOS A C, MAYER F Q, ROEHE P M. Full-Genome Sequence of Porcine Circovirus type 3 recovered from serum of sows with stillbirths in Brazil. Transboundary and Emerging Diseases, 2018, 65(1): 5-9.

[24] 王彩霞, 冯春燕, 刘丹丹, 张永宁, 杜方原, 林祥梅, 吴绍强. 猪圆环病毒3的流行及应对措施研究. 中国兽医杂志, 2017, 53(7): 101-104.

WANG C X, FENG C Y, LIU D D, ZHANG Y N, DU F Y, LIN X M, WU S Q. Study on the prevalence and countermeasures of porcine circovirus 3. Chinese Journal of Veterinary Medicine, 2017, 53(7): 101-104. (in Chinese)

[25] STADEJEK T, WOŹNIAK A, MIŁEK D, BIERNACKA K. First detection of porcine circovirus type 3 on commercial pig farms in Poland. Transboundary and Emerging Diseases, 2017, 64(5): 1350-1353.

[26] DAL SANTO A C, CEZARIO K C, BENNEMANN P E, MACHADO S A, MARTINS M. Full-genome sequences of porcine circovirus 3 (PCV3) and high prevalence in mummified fetuses from commercial farms in Brazil. Microbial Pathogenesis, 2020, 141: 104027.

[27] SHEN H, LIU X, ZHANG P, WANG L, LIU Y, ZHANG L, LIANG P, SONG C. Genome characterization of a porcine circovirus type 3 in South China. Transboundary and Emerging Diseases, 2018, 65(1): 264-266.

[28] 卢冰霞, 刘磊, 周英宁, 何颖, 秦毅斌, 段群棚, 李斌, 陈忠伟, 梁家幸, 苏乾莲, 闭炳芬, 蒋冬福, 卢敬专, 杨思仪, 赵武. 10株广西猪圆环病毒3型(PCV3)全基因组序列的遗传变异分析. 中国兽医杂志, 2020, 56(3): 20-24.

LU B X, LIU L, ZHOU Y N, HE Y, QIN Y B, DUAN Q P, LI B, CHEN Z W, LIANG J X, SU Q L, BI B F, JIANG D F, LU J Z, YANG S Y, ZHAO W. Genetic variation analysis of 10 complete genome sequences of porcine circovirus type 3 (PCV3) in Guangxi pig herds. Chinese Journal of Veterinary Medicine, 2020, 56(3): 20-24. (in Chinese)

[29] TODD D, WESTON J H, SOIKE D, SMYTH J A. Genome sequence determinations and analyses of novel circoviruses from goose and pigeon. Virology, 2001, 286(2): 354-362.

[30] ENGVALL E, JONSSON K, PERLMANN P. Enzyme-linked immunosorbent assay. II. Quantitative assay of protein antigen, immunoglobulin G, by means of enzyme-labelled antigen and antibody-coated tubes. Biochimica et Biophysica Acta, 1971, 251(3): 427-434.

[31] 湛洋, 王东亮, 王乃东, 蒋一凡, 黄坤, 崔尚金, 姜平, 杨毅. 猪圆环病毒3型检测及其Cap结构序列和抗原性预测分析. 畜牧兽医学报, 2017, 48(6): 1076-1084.

ZHAN Y, WANG D L, WANG N D, JIANG Y F, HUANG K, CUI S J, JIANG P, YANG Y. Survey on detection and analyses of cap antigenicity prediction of porcine circovirus type 3 isolated from partial provinces of southern China. Chinese Journal of Animal and Veterinary Sciences, 2017, 48(6): 1076-1084. (in Chinese)

Molecular Epidemic Characteristics and Genetic Variation Analysis of Porcine Circovirus 3 in Some Pig Farms in Central China from 2020 to 2022

Li BoTian1, Li ChunQi1, Liu GuoPing1, Xie Jun2, Zeng Pan1, Zhao RunZe1, Li Tong1, Pei Jie2, Guo LiWei1, Wu Rui3, Tan Lei1

1College of Animal Science and Technology, Yangtze University, Jingzhou 434020 Hubei,2Hubei Provincial Center for Animal Disease Control and Prevention, Wuhan 430000,3College of Veterinary Medcine, Sichuan Agricultural University, Chengdu 610000

【Objective】 The epidemiological and genetic variation characteristics of porcine circovirus 3 in some parts of central China were investigated through a systematic experimental protocol, which provided the data of basis for the research of PCV3 vaccine。【Methods】A total of 3 500 clinical samples collected from 15 large-scale pig farms in central China (Hubei, Hunan and Henan) were detected by real-time PCR, and the relationship between different pig herds, different tissues and organs, different amount of detoxification and the characteristics of corresponding epidemiological symptoms was analyzed. The whole genome of PCV3 for some positive samples was amplified, sequenced and analyzed.【Result】 50.86% (1 780/3 500) of the tested samples were positive for PCV3 nucleic acid, pigs at different ages were susceptible to PCV3, and the positive rates of PCV3 were higher in nursing pigs, suckling piglets and growing finishing, which were 70.44% (498/707), 67.19% (596/887) and 41.75% (177/424), respectively. The positive rates of PCV3 in lymph nodes, lung, and postpartum placenta samples were 67.05% (59/88), 63.79% (74/116), and 49.11% (55/112), while the positive rates of PCV3 in blood and colostrum samples were 56.09% (502/895) and 44.20% (278/629), respectively, and PCV3 was detected in nasal swabs and saliva. The positive rates of PCV3 was high in the pig with symptoms of reproductive disorder, which were 44.43% (399/898), 36.43% (431/1183), and 28.04% (233/831), respectively. The length of the whole genome sequence of the 24 PCV3 was 2 000 nt, and the homology of the whole genome nucleotide sequence among the 24 sample strains was 98.4%-100%, and the homology of the whole genome with the reference strain PCV3 at home and abroad was 97.4%-99.5%.Genetic evolution analysis showed that 23 strains of PCV3 belonged to the PCV3b subtype and 1 strain belonged to the PCV3a subtype. The results of Rep amino acid sequence alignment showed that PCV3-L2, L23 and L14 strains had unique variation sites in (N124I), (A183E) and (V244I), respectively. The results of Cap protein amino acid sequence alignment showed that PCV3-L15, L21, L3 and L19 strains had unique variation sites in (T45P), (R2K), (R14K) and (F7L), respectively.【Conclusion】 PCV3 can infect pigs at different ages and is distributed in different tissues and organs. PCV3 can infect pigs through vertical transmission (such as colostrum and semen) and horizontal transmission (such as oral and nasal secretions and saliva). PCV3 infection may be closely related to reproductive disorders, respiratory disorders, multiple organ inflammation and arthritis in pigs.In addition, both PCV3a and PCV3b subtypes were prevalent in large-scale pig farms in the surveyed area, and the PCV3b subtype was the dominant strain.In this study, genome-wide amino acid sequence analysis revealed that some unique variation sites were located in Cap protein, which may lead to changes in the immunogenicity conferred by Cap protein. In this study, the genetic evolution of the whole gene sequence of PCV3 is elaborated, aming to lay a foundation for future research on PCV3 vaccines.

porcine circovirus 3; viral load; whole genome amplification; genetic evolution analysis

10.3864/j.issn.0578-1752.2024.03.014

2023-10-27；

2023-12-25

湖北省重点研发项目（2023BBB045，2023BBB141）、石首市先行县“先进技术集成示范基地建设与定向攻关”揭榜项目（SS202311）

李博天，E-mail：lbtt15972737737@163.com。李春琪，E-mail：lcq1447324386@163.com。李博天与李春琪为同等贡献作者。通信作者刘国平，E-mail：hhaaiieerr@163.com。通信作者谢军，E-mail：393396890@qq.com

（责任编辑 林鉴非）