水稻颖壳异常突变体ah1的鉴定与候选基因分析

2024-03-04张必东林泓朱思颖李忠成庄慧李云峰

中国农业科学 2024年3期

张必东，林泓，朱思颖，李忠成，庄慧，李云峰

水稻颖壳异常突变体的鉴定与候选基因分析

张必东1,2，林泓1，朱思颖1，李忠成1，庄慧1，李云峰1

1西南大学水稻研究所/西南大学农业科学研究院/转基因植物与安全控制重庆市重点实验室，重庆 400715；2西南大学创新创业学院/含弘学院，重庆 400715

【目的】水稻是世界性的粮食作物，其籽粒形态直接影响水稻的最终产量和营养品质，进而影响其经济价值。此外，水稻花发育与籽粒形态又具有复杂的相关性，探究新的水稻花发育调控基因及其分子调控机制可以为培育籽粒更大、更饱满的水稻品种奠定基础。【方法】在利用甲基磺酸乙酯（ethyl methyl sulfonate，EMS）诱变西大1B（籼稻保持系）得到的突变体库中鉴定到一个颖壳和浆片发育异常且矮化的突变体（）；观察并统计野生型和突变体的农艺性状；选取各个时期的小穗，对突变体的组织学、形态学变化进行分析；采用和籼稻温敏不育系56S构建F2分离群体，并将其用于遗传分析和基因定位；提取野生型和突变体的幼穗RNA并将其反转录为cDNA，对花发育调控基因和ABA合成关键基因的表达量进行RT-qPCR分析。【结果】农艺性状分析表明，突变体各节间的大幅缩短直接导致其矮化；同时，突变体的小穗畸形严重，结实率极低。组织学和形态学分析发现，小穗主要表现为内外稃、浆片和雄蕊等花器官发生了不同程度的退化，部分严重的小穗出现了花器官特征和花分生组织确定性的改变，且伴随大面积的白化，根据其退化程度的不同可分为一般和严重2种类型。遗传分析发现分离群体中野生型和突变体的比值为3﹕1，表明突变性状受1个隐性基因控制。定位于第1染色体上的分子标记RM6716和RM128之间，物理距离近8 Mb，对突变体进行重测序分析后发现该区间内的和在野生型和突变体之间出现了变异，因此，将这两个基因暂定为候选基因。RT-qPCR分析表明，在突变体幼穗早期发育过程中，各花器官发育调控基因的表达量发生了显著的变化；同时，ABA合成关键基因////的表达严重受阻。【结论】对于维持水稻内外稃等花器官的形态建成起到至关重要的作用，将和暂定为候选基因。

水稻；颖壳；花发育；候选基因

0 引言

【研究意义】籽粒形态是影响水稻产量和品质的重要因素，而水稻颖壳等花器官的发育对籽粒形态的建成起到了决定性的作用。单子叶模式植物水稻作为一种重要的作物，其颖壳等花器官发育的分子遗传机制与以拟南芥为代表的双子叶植物仍存在着较多的差异[1-2]。所以，进一步探索水稻颖壳等花器官发育的机制，有利于通过相关基因进行颖壳等器官的分子设计，从而进行籽粒形态改良，提高水稻产量和品质。【前人研究进展】完整的水稻顶生小花由外到内一般分为内外稃、浆片、雄蕊和雌蕊共四轮花器官，雌蕊由一个胚珠和多个雌蕊组成。水稻等单子叶禾本科植物花器官的特征发育调控受到与拟南芥等双子叶植物类似的ABCDE模型的调控，A功能基因主要调控内稃和外稃的发育，并与B功能基因共同调控浆片的发育；B功能基因又和C功能基因共同调控雄蕊的发育；雌蕊的发育则主要是由C功能基因控制；胚珠特征的形成则由D功能基因决定；E功能基因不单独决定某一轮花器官的特征，其对所有轮次的花器官的发育都非常重要[3-6]。水稻中的ABCE功能基因如下：（1）A功能基因包括、和，属于SQUA家族，与拟南芥的（）同源。调控第一轮花器官的发育，当所有花器官原基发育完成后，的表达被限制在护颖、内稃和外稃中[7]。对内稃主要结构和颖片的特征发育是必需的，其可能参与了抑制早期花原基中的茎尖分生组织的形成[8]。在所有花器官中都有表达，其RNAi植株无任何明显的表型改变，但过表达可诱导早花，可能与其他MADS-box转录因子的功能冗余[9]。同时，//还与/共同作用决定花序分生组织的特征[10]。（2）B功能基因包括（）/、和，与（）同源。可以抑制雄蕊和浆片分别转化为雌蕊和内稃样器官，在调节轮次特异性增殖中具有特定的功能，在引入带有cDNA片段的双链RNA的转基因株系中可以观察到部分雄蕊转化为雌蕊，同时，与具有相互拮抗的作用，的异位表达导致了雌蕊被雄蕊取代[11-13]。和与（）同源，可以控制浆片的形成，而不影响雄蕊的发育，其具有在沿近端-远端轴控制细胞分裂和分化的功能，是触发薄壁组织和浆片特有导管的发育和保持浆片器官大小所必需的[14]。是决定浆片和雄蕊特征的主要同源物，能阻止C功能基因和在浆片中的异位表达，和具有显著的序列相似性，特别是MADS-box结构域之间具有89%的相同性，研究证明二者存在部分功能冗余[15-17]。（3）C功能基因包括/和，它们都是拟南芥中（）的直系同源基因，是在植物进化过程中的基因重复事件中产生的，已经部分亚功能化，和决定了雄蕊和雌蕊的特性，并与一起维持花分生组织的确定性，其中，在调节花分生组织的确定性方面起着至关重要的作用，同时负责雌蕊正常形态的发生，而主要决定雄蕊的特征和抑制异位浆片的分化[17-19]。、和可能通过协同作用来定义第二轮花器官和生殖轮次之间的正确边界[20]。（）编码一个具有YABBY结构域的C2H2型锌指蛋白，也在第四轮花器官中起作用，可能与包括C功能基因在内的基因一起调控雌蕊的发育，并不作用于C功能基因的上游，研究发现与B功能基因互相拮抗并控制花分生组织的确定性，可能在水稻进化过程中发挥了更重要的指定雌蕊特征的功能[11, 18, 21]。（4）D功能基因包括和，与、和同源，控制胚珠的特征，其表达局限于胚珠，而很可能是的类似物，其在进化过程中失去了决定胚珠特征的能力[22-24]。（5）E功能基因较多，功能较为复杂，拟南芥中有///（///），水稻中与之同源的有/、、/、和。是一种早期作用的花内部器官调节因子，通过控制水稻内稃和外稃中特定细胞类型的分化来决定内外稃的特征，的过表达则会促进花分生组织的确定及内外稃的形成[25-27]。在花药中优先表达，且该基因在花药发育前期的表达量高于后期，由于与其他SEP基因功能冗余，其突变体的小穗并未出现较大变化，而、、和同时沉默的植株的所有花器官全部转化为叶状器官，小花也失去了确定性，说明它们能同时决定叶片向花器官转化的过程[28-30]。编码一种含有短羧基末端的MADS-box蛋白，是不育外稃形成的一个关键调节因子，防止在小穗分生组织内的不育外稃原基上形成外稃/叶状器官，可能与/同时调节不育外稃的发育，也与结合后共同决定内外稃、浆片、雄蕊和雌蕊的特征[31]。和功能冗余，它们对花内部3个轮次的发育和花分生组织确定性的维持是必需的[30]。除了已经鉴定到的ABCDE模型中的基因，还有一些基因同样也可以调控颖壳等花器官的发育，（）/和属于AGL6分支亚家族，优先在花器官中表达，MFO1是早期花发育的关键调节因子，通过激活B、C功能基因以及SEP类似基因的表达，参与调节浆片、雄蕊和雌蕊的发育，同时决定分生组织的确定性[32]。可能是在进化过程中出现的一个MFO1的重复，的作用较小且与MFO1冗余，对花发育的过程没有太大影响[32-33]。（）/属于MDAS-box基因家族的一个单子叶特异性分支，通过负向调控的表达以维持花器官的特征，还与、、在抑制第二轮异位花器官的启动和维持浆片的不对称发育中共同发挥着重要作用[34]。（）参与调控花序组织的结构、花器官的特征和叶片的生产效率，能与和互作，冗余地控制花分生组织细胞的增殖，其还在花发育过程中正向调控C功能基因的表达[35]。（）编码一个C2H2锌指蛋白，与拟南芥密切相关，通过正向调控的表达来决定浆片和雄蕊的特征[36]。（）是一个调控花分生组织活性和花器官数量的基因，编码一个富亮氨酸重复受体激酶，与通过不同的途径控制第三、四轮花器官的数量[37]。【本研究切入点】先前的研究对于水稻颖壳等花器官的特征发育（即从花分生组织到器官原基的形成阶段）调控机制提供了较多的证据，然而对于花器官从原基到成熟这一过程的形态建成机制研究相对缺乏。【拟解决的关键问题】本研究在西大1B的EMS诱变库中筛选并鉴定到了一个突变体，其表现为内外稃严重退化，内轮花器官发育紊乱，故命名为（），通过对其开展形态学和组织学分析、农艺性状分析、遗传鉴定、基因定位和RT-qPCR等研究，为理解水稻颖壳等花器官形态建成的分子机制提供新的基因资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

突变体材料是在利用甲基磺酸乙酯（ethyl methyl sulfonate，EMS）诱变籼稻保持系西大1B（XD1B）得到的突变群体中鉴定到的，经过多年的连续世代自交，突变体性状已稳定遗传。该突变体穗发育后期小穗的内外稃退化严重，故命名为（）试验材料均由西南大学水稻研究所提供，种植于西南大学水稻研究所北碚歇马种植基地。

1.2 形态学和组织学分析

在水稻孕穗期，从田间取水稻幼穗，利用HITACHI SU3500扫描电子显微镜观察幼穗的发育情况。在水稻抽穗期，取野生型和突变体的小穗放入FAA溶液中，用真空泵将小穗抽真空后，4 ℃固定16 h以上，随后对其进行脱水、透明处理，使用56—58 ℃的石蜡包埋小穗，处理好的材料使用LEICA RM2245石蜡切片机切成8 µm厚的薄片，切片经脱蜡、染色和烘干后放于NIKON E600光学显微镜下观察。在水稻开花期，采集野生型和突变体的小穗并用塑料薄膜密封保存，在NIKON SMZ1500立式显微镜下观察其花器官在花发育后期的形态特征。

1.3 农艺性状分析

将野生型和种植于田间，常规水肥管理，全生育周期观察。随机选取田间正常生长至成熟的野生型和的完整植株各10株，观察其形态特征并统计主要农艺学性状，使用IBM SPSS Statistics 24.0软件分析样本间是否具有显著差异。

1.4 遗传分析

以56S与突变体为亲本进行杂交，利用F2代分离群体进行遗传分析。观察并统计F1自交得到的F2代中突变体单株和野生型单株的数量，采用SAS软件进行卡方检验。

1.5 基因定位与候选基因分析

以56S与突变体为亲本杂交得到F2代群体作为定位群体，采用BSA法（bulked segregation analysis，群体分离分析法），构建突变体和野生型基因池，参照设计覆盖12条染色体的300对分子标记对2个基因池进行筛选。其中SSR引物是根据Gramene网站公布的序列，并参照日本晴序列设计的；In/Del引物则是利用Vector NTI Advance 10.3软件根据实验室已测序的籼稻品种西农1A和缙恢10号的序列设计的（表1），并交由北京擎科生物技术有限公司合成。本研究用到的基因注释信息来源于http://www.gramene.org/和http://rice.uga.edu/。

1.6 RT-qPCR分析

取孕穗期突变体和野生型的幼穗于液氮中保存，使用北京庄盟国际生物基因科技有限公司的KK超快植物总RNA提取试剂盒（ZP405K）提取幼穗的总RNA，并迅速反转录为cDNA。使用荧光（SYBR Green）定量PCR的预混体系，以为内参基因，每个样本设置3个重复，利用Bio-RadX96 PCR仪进行RT-qPCR定量分析，采用2-DDCt法计算相对表达量与标准差，差异显著性检测则采用检验法进行。设计定量相关引物并对相关基因在水稻幼穗中的表达量进行分析（表1）。

2 结果

2.1 ah1突变体的表型分析

野生型水稻的小穗紧密而有序地排列在穗轴上，小穗的3对颖片呈1/2互生叶序排列在小穗轴上，包括1对极度退化的副护颖、1对护颖和内外稃（合称颖壳），花器官则分为内外稃、1对浆片、6个雄蕊和1个雌蕊共四轮，完整小穗的外稃和内稃紧密闭合，将花器官与外界隔开，为后续籽粒的受精、灌浆和成熟提供条件（图1-A1—A2和图1-A5）。

突变体小穗中器官发育表现出明显的退化，按程度可分为一般和严重2种。一般表型的小穗的内外稃明显变小，闭合度不足，顶端略微弯曲（图1-B1—B2和图1-B5）；另外内外稃和雄蕊颜色泛白；严重表型的花序出现严重退化，枝梗和小穗大面积变白，小穗内外稃明显退化变小，并出现不同程度的畸变，大部分小穗花器官外露，浆片发育异常且顶端伸长，雄蕊减少、雌蕊增多（图1-C1—C2和图1-C5）。通过扫描电镜观察花原基起始和形成的早期发育情况，发现与野生型相比，突变体在Sp6期之前并没有表现出明显的内外稃或其他花器官的异常发育（图1-A3、图1-B3和图1-C3），但是在Sp8期之后，内外稃的发育出现异常，出现不同程度的退化，导致其不能闭合（图1-A4、图1-B4和图1-C4）。突变体的内外稃不能正常勾连，可能导致灌浆困难、籽粒难以成形，育性降低（图1-A5、图1-B5和图1-C5）。结果表明，突变导致水稻颖壳、雄蕊等花器官出现了发育退化。

表型严重的小穗还可以进一步分为以下三类，类型Ⅰ内稃极度伸长、外稃严重退化、其外表皮硅化细胞变为泡状细胞，内外稃无法勾合，花器官部分暴露，浆片异常发育、表面凹凸不平且2个浆片融合为一体（图1-D1—D6）；类型Ⅱ内外稃严重退化，雄蕊几乎完全消失并转化为雌蕊，外稃部分外表皮硅化细胞退化呈现护颖表皮特征，浆片顶部出现伸长；这两种类型的变化表明突变也会影响颖壳、浆片、雄蕊的特征发育（图1-E1—E4）；另外类型Ⅲ的小穗轴上出现了额外的小花，说明在生长过程中花分生组织可能失去了确定性（图1-E5）。

A1：野生型小穗；A2：去除内外稃后的野生型小穗；A3：Sp6期的野生型花原基；A4：Sp8期的野生型花原基；A5：野生型小穗的横切面；B1：ah1的小穗；B2：去除内外稃后的ah1的小穗；B3：Sp6期一般表型的突变体的花原基；B4：Sp8期一般表型的突变体的花原基；B5：一般表型的ah1的小穗横切面；C1和C2：突变表型严重的完整小穗及去除内外稃后的小穗；C3：Sp6期严重表型的突变体的花原基；C4：Sp8期严重表型的突变体的花原基；C5：严重表型的ah1的小穗横切面；D1和D2：内稃伸长、外稃退化、浆片异常发育的ah1小穗（类型Ⅰ）；D3：退化的内稃，D2红框内的放大图；D4：D2小穗中异常发育的浆片；D5：D1小穗退化内稃的横切图；D6：D1小穗异常浆片的横切图；E1和E2：雄蕊雌蕊化、内外稃退化、浆片伸长的ah1小穗（类型Ⅱ）；E3：退化的外稃，E2红框内的放大图；E4：E2小穗中伸长的浆片；E5：ah1中的双花小穗（类型Ⅲ）。le：外稃；pa：内稃；lo：浆片；st：雄蕊；pi：雌蕊；sl：护颖；rg：副护颖；mrp：内稃边缘；dl：退化的外稃；ele：伸长的外稃；alo：异常的浆片；elo：伸长的浆片；ex-floret：额外的小花；*：雄蕊。标尺：A1和A2均为5 000 µm；B1、B2、C1、C2、D1、E1和E5均为1 000 µm；A4、A5、B4、B5、C4、C5、D4、D5和D6均为500 µm；D2、E2均为2 000 µm；A3、B3、C3、D3、E3和E4均为100 µm

2.2 农艺性状分析

观察野生型和突变体的生长全过程，发现幼苗在三叶期之前与野生型无明显差异，随着幼苗的不断生长，突变体和野生型植株的株高差异逐渐明显，直至抽穗期后不再发生变化，此时突变体的株高为野生型的74.46%（图2-A和图2-D）。取野生型和突变体的稻穗进行观察并测量，发现突变体矮化的原因在于其节间的大幅缩短，统计结果显示，突变体倒一节间—倒四节间分别缩短为野生型的53.23%、54.57%、50.08%和44.13%（图2-B—C和图2-E）。同时，由于突变体的小穗发育异常，导致其育性降低、结实困难，统计发现突变体的结实率和千粒重仅分别为野生型的30.04%和41.5%，均出现了极显著下降（图2-F—G）。

2.3 突变性状的遗传分析

以突变体为父本、温敏不育系56S为母本进行杂交，观察并统计F1和F2的性状，发现F1均为正常性状，F2中出现突变性状分离，群体中野生型303株，突变体97株，数据经卡方检验后显示野生型：突变体为3﹕1（c2=0.083＜c20.05,1=3.84），说明性状受隐性单基因控制（表2）。

A：野生型与突变体的成熟期植株；B和C：野生型与突变体的稻穗（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ分别代表倒一节间、倒二节间、倒三节间和倒四节间），标尺：5 cm；D：株高统计；E：节间数统计；F：结实率统计；G：千粒重统计。**：t检验中P＜0.01，差异极显著。下同

表2 野生型和ah1突变体分离的卡方测验

2.4 AH1的定位与候选基因分析

利用56S和突变体杂交，将F2群体用于基因定位，从中选取具有正常表型和突变表型的单株各10株，取等量叶片，构建正常基因池和突变基因池。使用均匀分布在12对染色体上的300对SSR和In/Del标记来筛选2个基因池，发现第一染色体上的RM6716和RM1268标记出现了明显的连锁遗传，计算发现其交换率分别为25.00%和3.75%。取30株突变植株对这两个标记及其邻近的RM128标记进行验证，将基因初步定位在RM6716和RM128之间，物理距离约8 Mb（图3-A）。

为进一步确定候选基因，对突变体进行基因组重测序分析，相比于野生型，突变体该区间内有2个基因发生了点突变（表3），基因组重测序结果显示，的第三外显子上第590位碱基发生了由G到A的点突变，的内含子上第997位碱基发生了由A到T的点突变。这两个基因都非常靠近分子标记RM128，它们分别编码一个转氨酶和一个紫黄素脱环氧化酶。拟南芥中编码一个8-氨基-7-氧代壬酸合酶的（）和水稻中编码一个紫黄素脱环氧化酶的（）突变后的植株性状，尤其是叶绿素和株型的变化，与类似。同时，和的功能可能分别与和的功能相似，故将和暂定为的候选基因。在小于3 mm和小于1 cm的突变体幼穗中，这两个基因的相对表达量都出现了显著下降（图3-B—E）。对ABA含量进行检测后发现，中的ABA含量同样出现了显著的减少（图3-F）。

A：AH1在第一染色体上的初步定位；B、C：LOC_Os01g53450和LOC_Os01g51860在小于3 mm的幼穗中的相对表达量；D、E：LOC_Os01g53450和LOC_Os01g51860在小于1 cm的幼穗中的相对表达量。F：野生型和突变体中的ABA含量

表3 突变基因

2.5 花器官特征基因和ABA合成基因的表达分析

为了研究突变对水稻花器官发育调控基因的影响，采用RT-qPCR对野生型和突变体进行了分析。

在小于3 mm的突变体幼穗中，A功能基因、和E功能基因的表达量出现了显著降低；表达量同样出现下降的还有、、和；与之相反的是，B功能基因（、、）、C功能基因（、）、D功能基因（）、E功能基因（、、）和其他调控基因（）的表达量均出现上升（图4-A）。在3 mm的幼穗中，大部分的小穗处在Sp3—Sp5时期，也就是内外稃原基起始和发育的时期，值得注意的是，A功能基因、和E功能基因与颖壳发育有关，它们的表达变化与突变体表型是相关联的。而在1 cm左右的突变体幼穗中，RT-qPCR结果发现，所有花器官调控基因的相对表达量都出现了极显著下降，这个时期小穗发育大多处在Sp6—Sp8时期，也就是花器官原基已经形成，正在进行下一步的形态建成。结果表明，突变体的花器官原基在这个时期已经开始出现退化甚至细胞死亡，从而导致花器官发育基因的全部表达下调（图4-B）。

A：小于3 mm的幼穗中花器官发育调控基因和ABA合成基因的相对表达量（OsNCED2/OsNCED3几乎无表达，数据未展示）；B：小于1 cm的幼穗中花器官发育调控基因和ABA合成基因的相对表达量（OsMADS18和OsNCED2/OsNCED3几乎无表达，数据未展示）。*：t检验中P＜0.05差异显著

另外，有研究表明在干旱胁迫下，植株中的ABA含量会上升，以保护光合器官免受强光损伤，由于突变体出现白化的表型，所以我们对ABA合成相关基因的表达进行了进一步检测[38]。RT-qPCR结果显示，无论是在小于3 mm的幼穗还是在小于1 cm的幼穗中，//都表现出极显著减少，这个结果暗示编码的蛋白可能参与调控了//的表达和ABA的合成，从而影响植物叶绿素的功能（图4-A—B）。

3 讨论

3.1 AH1在颖壳等花器官的发育中发挥了重要作用

水稻产量主要由三要素组成，分别是单位面积有效穗数、每穗粒数和千粒重，而水稻的籽粒形态建成以及花器官发育直接决定了千粒重，所以水稻颖壳等花器官发育基因的研究对于籽粒形态的分子改良具有重要意义。

本研究中，是一个内外稃发育严重退化的突变体，同时还表现出内轮花器官的发育紊乱。在已经鉴定的水稻花发育基因突变体中，有一些表型与相似。是的一个突变体，严重表型的小穗中内稃特征丢失，外稃也受到轻微影响，浆片转化为颖片状器官[8]；和是的2个等位突变体，突变体的小穗包含叶状的内稃和外稃，颖壳开裂，浆片变为类似内稃/外稃的叶状器官，的外稃和内稃过度发育，浆片也向内稃/外稃样器官转化[26-27]；的小花分裂、内稃弯曲，内稃边缘区域变宽，导致内稃的原叶钩消失而无法与外稃的相应钩形成连锁结构[34]。的第一、二轮花器官也表现出了与上述类似的突变性状，RT-qPCR结果显示，花发育早期的、、和的表达量就已经显著降低，暗示突变导致A功能基因和部分E功能基因在外两轮花器官中的正常表达受阻。B功能基因的突变导致雄蕊和浆片分别转化为了雌蕊和内稃样器官[11-12]；反义转基因植株的浆片和雄蕊同源转化为内稃样器官和雌蕊[15, 17]；的敲除导致远端区域继续生长，形成延伸的苞片状结构，转化后的浆片基底部或近端部分也明显变大[14]；是的直系同源物，调节干细胞增殖和器官启动，敲除突变体的雌蕊和雄蕊增多，花分生组织的功能比野生型花分生组织的功能持续时间长：在外部三轮花器官原基启动后，剩余的中央花分生组织继续在第三轮内部产生额外的雄蕊原基，花分生组织活动的延长也导致雌蕊数量的增加[37-39]；敲除植株表现出雄蕊同源转化为浆片[18]；的浆片和雄蕊均同源转化为稃片状器官和雌蕊，产生的花具有不同数量的内部花器官，并且在内部两轮花器官中经常形成没有花器官特征的无定形组织[36]；过表达会产生额外的浆片、雄蕊和雌蕊样器官。、、、、、和突变后的性状与中雄蕊几乎全部转化为雌蕊、浆片伸长呈稃片状的表型非常相似。RT-qPCR结果显示，在小于1 cm的幼穗中，上述所有花器官发育控制基因的表达量均出现了显著降低，暗示突变导致这些基因的表达下调。综上，推测在花器官发育过程中参与调控ABCDE基因和其他控制基因的表达，进而影响了花器官特征发育和形态建成。

3.2 AH1候选基因的分析

本研究确定了的2个候选基因。其中，编码了一个紫黄素脱环氧化酶家族蛋白，具有紫黄素脱环氧化酶活性，参与叶黄素循环；水稻（）同样编码一个紫黄素脱环氧化酶，其在茎和穗中表达量较高，编辑突变抑制了水稻的生长和穗部发育，使用CRISPER-Cas9介导的基因编辑株系（C-1和C-2）表现出矮化、穗短、节间短和结实率低等性状，与突变后的性状几乎完全吻合[40]。枸杞（）中的VDE基因的氨基酸序列与其他植物的VDE基因具有高度同源性，干旱胁迫下，植株中的ABA含量会上升，保护光合器官免受强光损伤[38]。在中，//的表达量均极显著下调，且ABA含量大幅下降，这可能导致植物叶绿素被高光照破坏，从而出现花器官和穗轴大面积泛白的表型。另一个候选基因编码一个氨基酸转运酶，分子功能为磷酸吡哆醛结合，参与生物合成的过程，这与8-氨基-7-氧代壬酸合酶（AONS）类似。AONS是一种吡哆醛5′-磷酸依赖酶，作用于生物素生物合成的第一步。而生物素是大多数生物的必需营养素，动物只能从食物中摄取生物素，而植物、微生物和一些真菌可以自己合成生物素，如果植物的生物素合成途径的酶活性降低，则植物会受到不可弥补的伤害[41-42]。研究显示AONS基因表达受到限制的拟南芥的叶片中的叶绿素含量会大幅降低，并导致植物的茎和叶变黄甚至死亡，补施生物素后的植株的形态和叶绿素含量能恢复正常。（）是拟南芥中编码AONS的基因，一个的T-DNA插入突变体的植株形态明显变小。与野生型相比，突变体较早地进入生殖生长，但种子产量却急剧下降[43]。在本研究中，表现出了植株矮化、叶片黄化、稻穗变白、产量降低等性状，与突变体的表型极为相似。所以，的2个候选基因都有可能通过影响叶绿素的功能来调控花器官的形态建成和植株的发育，最终的确定还有待进一步的遗传互补试验来验证。

4 结论

在西大1B的EMS诱变库中鉴定到了一个颖壳严重退化、花器官发育紊乱矮化突变体，命名为。该性状受隐性单基因调控，其定位于第1染色体上的SSR引物RM6716和RM128之间，物理距离近8 Mb，将和暂定为的候选基因。是花器官发育调控基因和ABA合成基因的上游调控基因。

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Identification and Candidate Gene Analysis of the() Mutant in Rice (L.)

ZHANG BiDong1,2, LIN Hong1, ZHU SiYing1, LI ZhongCheng1, ZHUANG Hui1, LI YunFeng1

1Rice Research Institute, Southwest University/Academy of Agricultural Sciences, Southwest University/Chongqing Key Laboratory of Application and Safety Control of Genetically Modified Crops, Chongqing 400715;2Institute of Innovation and Entrepreneurship, Southwest University/Hanhong college, Chongqing 400715

【Objective】Rice is the staple grain crop worldwide, and the morphology of its grains directly influences its ultimate yield, nutritional excellence, and economic significance. Moreover, the intricate interplay between floral development and grain morphology adds further significance to this relationship. Thus, exploring novel rice floral development regulatory genes and molecular regulatory mechanisms lays the foundation for larger and more plump grains rice varieties. 【Method】Ethyl methyl sulfonate (EMS) was used to mutate XD1B (xian-type maintainer line), and a dwarf mutant() with abnormal formation of glume and lodicule was identified. The agronomic traits of both the wild-type and mutant were observed and recorded. Spikelets from various flowering stage were collected to histological and morphological analysis. The F2segregating population was established byand 56S (xian-type thermo-sensitive sterility line), and utlized for genetic analysis and gene mapping. RNA was isolated from young panicles of both the wild-type and mutant, then reverse transcribed into cDNA. The RT-qPCR analysis was performed to analyze the relative expression levels of the genes regulating floral development and the key genes in the ABA synthesis pathway. 【Result】The observation of agronomic traits revealed that the dwarfed plant was caused by the dramatic shortening of the internodes. At the same time, the mutant is also accompanied by severe spikelet abnormalities and low fruit setting rate. Histological and morphological analysis revealed that themutant spikelets exhibited varying degrees of degeneration in floral organs such as palea, lemma, lodicules, and stamens. Some severely affected spikelets displayed altered floral organ characteristics and determinacy of floral meristems, often accompanied by extensive whitening. Based on the extent of degeneration, these spikelets could be classified as slight or severe mutant phenotypes. Genetic analysis showed a segregation ratio of 3﹕1 for the wild-type and mutant within the segregating population, indicating that the mutant traits ofwere controlled by a single recessive locus.Thewas mapped between the molecular markers RM6716 and RM128 on the chromosome 1, with a physical distance of approximately 8 Mb. Resequencing analysis of the mutant revealed that theandwithin this interval showed variation between wild-type and mutant, thus these two genes were provisionally identified as candidate genes.RT-qPCR analysis revealed significant alterations in the relative expression levels of floral organ development regulatory genes during the early developmental stages of mutant panicles; meanwhile, the relative expression levels of////, the ABA synthesis pathway key genes, were severe inhibited.【Conclusion】plays a crucial role in the morphological formation of floral organs, such as palea and lemma in rice.andwere provisionally identified as candidate genes in this work.

rice (L.); glume; floral development; candidate genes