响应面法优化枸杞发酵工艺

刘静凤，孔维波，陈思敏，刘春秀，付丹阳，梅青刚，姜立春*

（1.绵阳师范学院资源环境工程学院，四川绵阳 621000；2.绵阳师范学院生命科学与技术学院，四川绵阳 621000）

0 引言

宁夏枸杞（LyciumbarbarumL.）为茄科（Solanaceae）枸杞属（Lycium）落叶灌木［1-2］，由于其富含人体所需的32种微量元素和18种氨基酸［3］，以及枸杞多糖、甜菜碱、类胡萝卜素等多种活性成分，具有抗氧化、抗疲劳、增强免疫力等功效［4-8］，有较高的药用保健功能和营养价值，广泛应用于泡酒、泡茶、煮粥［9-11］.

枸杞果酒是以枸杞为原料经发酵制成的含酒精的饮料，由于其具有较低的酒精度、浓郁的果香味并且还保留了枸杞原有的多糖、氨基酸和矿物质等天然活性成分，且符合当今酒类消费所倡导的以低酒精度取代高酒精度、果酒取代粮食酒的潮流，在酒种的发展中具有很大的潜力［12-13］.目前市售枸杞果酒大多采用干枸杞进行发酵，而对于新鲜枸杞果酒加工工艺优化的报道相对较少.且常用感官评分作为评价指标优化发酵工艺，对于酒香与口感评判具有较强的主观性，缺乏生物活性物质含量作为客观的品质指标来指导工艺优化过程.

本试验以宁夏新鲜枸杞为原料，以枸杞发酵后的酒精度和感官评分值为指标，在单因素试验的基础上结合响应面法优化选取枸杞发酵工艺的最优参数条件，使发酵液酒精度和感官评分值达到最佳水平，从而为枸杞发酵产品的研制与开发提供试验依据与理论支持，对进一步改善枸杞果酒的酒体品质具有一定的借鉴价值.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

枸杞（杞利元宁夏枸杞店）、酵母菌（安琪酵母股份有限公司）、果胶酶（河南万邦实业有限公司）、NaOH（天津市致远化学试剂有限公司）、浓盐酸溶液（天津市致远化学试剂有限公司）.

1.2 仪器

SW-CJ-1FD 超净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）、MLS-3020 高压蒸汽灭菌锅（上海旦鼎国际贸易有限公司）、SC-3610低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）、LKTC-B1恒温水浴锅（常州普天仪器制造有限公司）.

1.3 试验方法

1.3.1 枸杞发酵工艺 将枸杞剪碎，按照液料比利用蒸馏水浸提以制备枸杞混悬液，而后加入果胶酶并调节pH，进行高压蒸汽灭菌后，再接种活化酵母菌液，进行恒温发酵处理.发酵一段时间后进行过滤、高速离心，取发酵上清液进行指标检测.

1.3.2 单因素试验 在不改变其他发酵参数的前提下，依次选取不同发酵时间（3、5、7、9、11 d）、发酵温度（27、29、31、33、35 ℃）、接种酵母质量分数（0.5%、1.0%、1.5%、2%、2.5%）、液料比（10：1、15：1、20：1、25：1、30：1）和pH 值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）进行单因素发酵试验，以酒精度、感官评分为评价指标，确定各因素对枸杞发酵液酒精度、感官评分的影响.

1.3.3 酒精度的测定 参考国标《GB/T 15038—2006 葡萄酒、发酵液通用分析方法》的乙醇体积百分数的测定方法，为酒精测度法.

1.3.4 感官评定 离心分离后的枸杞发酵液，参照国标《GB/T 15038—2006 葡萄酒、发酵液通用分析方法》进行感官评定，感官评分标准见表1.

表1 发酵液感官评分标准Tab.1 The standard for sensory evalution of fermentation broth

1.3.5 响应面优化试验 基于单因素试验结果，选取发酵时间（A）、发酵温度（B）以及接种酵母质量分数（C）为考察变量，-1、0、1分别代表变量的水平，并以酒精度（Y1）和感官评分（Y2）作为响应值，利用Design-Expert 13 软件设计三因素三水平的响应面试验，试验设计因素和水平见表2.

表2 响应面试验因素及水平Tab.2 Response surface test factors and levels

1.4 数据处理

使用Excle、Origin 2021 软件进行绘图和数据统计分析，Design-Expert 13 软件进行响应面优化分析.

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 发酵时间对枸杞发酵的影响 随着发酵时间的延长，接种的酵母菌逐渐从有氧呼吸增殖过程转化为无氧呼吸产生酒精，由图1 可知，发酵时间为5 d 时，枸杞发酵液的酒精度及感官评分达到峰值，分别为2.2% vol 和68 分.当发酵时间低于5 d 时，由于酵母菌的生长时间短，代谢过程中产生酒精的积累量较少，导致酒精度较低，发酵液风味不佳，感官评分值偏低；当发酵时间较长，超过5 d 时，发酵液中其他菌类的繁殖会争夺所需要的营养为食，从而抑制酵母菌的生长，导致其他代谢物杂质的积累量增加，酒精积累量减少，且随着发酵时间的延长发酵液中的苦涩味越明显，导致酒精度和感官评分值均呈现下降趋势.因此，确定最佳发酵时间为5 d.

图1 发酵时间对枸杞发酵液酒精度、感官评分的影响Fig.1 Effect of fermentation time on the alcohol content and sensory score of Lycium barbara fermented liquor

2.1.2 发酵温度对枸杞发酵的影响 枸杞多糖经过糖化转变为葡萄糖供给酵母菌利用，发酵温度与糖化速率成正相关，即发酵温度越高糖化速率越快.于酵母菌而言，当发酵温度较低时，其生长繁殖和代谢不旺盛，从而导致发酵液的酒精度偏低，且酒香味不醇厚，导致感官评分值较低；当发酵温度偏高时，虽然对酵母菌的生长繁殖有促进作用，但高温会导致发酵液中易于挥发的香气成分加速流失，影响整体香气，导致感官评分值降低，所以需要寻找合适的温度来优化发酵产品效果.因培养瓶中已添加了酵母生长繁殖所需的各类营养物质［14］，在此均衡条件下，适宜温度的选择对酵母耐受性和发酵性能得到较好体现密切相关，且更有利于发酵产物积累［15］.由图2 可知，在31 ℃时发酵液以酒精度2.4%vol 和感官评分值72 分达到最高点，当温度低于或高于31 ℃时都酒精度曲线呈现出明显下降的趋势.因此确定31 ℃为枸杞发酵最适温度.

图2 发酵温度对枸杞发酵液酒精度、感官评分的影响Fig.2 Effect of fermentation temperature on the alcohol content and sensory score of Lycium barbara fermented liquor

2.1.3 接种酵母质量分数对枸杞发酵的影响 随着接种酵母质量分数的增加，酵母菌之间竞争营养物质来满足自身生长繁殖的状况越发激烈，可能会产生拮抗作用，反而使糖的利用率降低，导致酒精度积累量减少.由图3 曲线的变化趋势可知，接种酵母质量分数对酒精积累量有着显著影响，当接种量为1.5%时，此时酒精的积累量和感官评分均处于最高水平，分别为2.3%vol 和75 分，营养成分溶出相对较高，当接种量低于1.5%时，酵母菌代谢产物累积量较少，发酵液整体风味不佳，导致酒精度和感官评分值偏低；当接种量超过1.5%后，由于酵母菌对营养物质的竞争作用，使得各自发酵的底物减少，导致酒精度和感官评分值降低［16］.因此确定最佳接种酵母质量分数为1.5%，能够得到较好的发酵结果.

图3 接种酵母质量分数对枸杞发酵液酒精度、感官评分的影响Fig.3 Effect of inoculated yeast mass fraction on the alcohol content and sensory score of Lycium barbara fermented liquor

2.1.4 液料比对枸杞果酒发酵液质量的影响 乔博鑫［17］的研究表明，液料比对酵母菌体的增殖存在影响，当液料比较低时，发酵液过于黏稠，可能会因为料液体积较小导致溶氧量不足，使酵母菌繁殖速度减慢，不利于其生长，使发酵液酒精度和感官评分低.而液料比偏大即过度稀释，可能会因为初始糖浓度不足，也不利于酵母菌的增殖和发酵，会导致酒精积累量较少，且过高的液料比会导致发酵液的口感较差、色泽偏淡，香味物质的辨识度下降，酒精度和感官评分值降低.由图4 可知，枸杞发酵液的酒精度及感官评分受液料比的影响不显著，整体呈现较为平稳的状态.在液料比为20：1时，发酵液的酒精度及感官评分值分别为2.1%vol和77分，因此确定最佳液料比为20：1.

图4 液料比对枸杞发酵液酒精度、感官评分的影响Fig.4 Effect of liquid-solid ratio on the alcohol content and sensory score of Lycium barbara fermented liquor

2.1.5 pH 对枸杞果酒发酵液质量的影响 当枸杞发酵液的pH 较低时，酵母菌不易在此过酸的条件下生长繁殖，此时其代谢产物累积量较少，导致酒精度偏低；而当pH 偏高时，发酵液中的酸味不足且不利于酵母菌生长.由于酵母菌的代谢繁殖，初期会导致酸性中间产物大量产生，致使发酵液的pH 有所下降，而后中间产物在发酵过程中作为能量物质继续被利用消耗，pH 值缓慢回升［18］.由图5 可知，pH 的改变对酒精度和感官评分的影响并不明显.本试验与李彩霞［19］等人研究结果相似，酵母菌生长最适pH4.0～5.0 左右，此阶段的酒精度与感官评分值均处于较高水平.当pH=5.0 时，枸杞发酵液香气浓郁，口感良好，酸甜适中，色泽均匀，此时的酒精度为2.0%vol、感官评分为80分，故枸杞发酵最适pH=5.0时可以得到较好结果.

图5 pH对枸杞发酵液酒精度、感官评分的影响Fig.5 Effect of pH value on the alcohol content and sensory score of Lycium barbara fermented liquor

2.2 响应面优化试验结果

利用Design-Expert13 软件，应用Box-Behnken 试验原理，根据试验方法1.3.5 进行响应面试验设计，设计结果见表3.并对其试验数据采用多元回归分析，分别获得Y1、Y2的回归模型方差分析结果（见表4），再经多元线性回归方程拟合，所得结果如下：

表3 响应面试验设计及结果Tab.3 Response surface test design and results

表4 枸杞发酵酒精度及感官评分回归模型方差分析Tab.4 Variance analysis of regression model for alcohol content and sensory evaluation of Lycium barbara fermentation broth

Y1=2.56+0.150A+0.112 5B+0.237 5C-0.050AB-0.050AC+0.075BC-0.392 5A2-1.07B2-0.517 5C（2R2=0.998 2，P<0.000 1）

Y2=80.40+3.75A+4.13B-0.125C-0.750AB+0.250AC-1.50BC-24.95A2-9.70B2-9.20C（2R2=0.999 6，P<0.000 1）

由响应面的方差分析结果可知，酒精度（Y1）和感官评分（Y2）的回归模型显著性结果均显示为P<0.000 1，均为极显著，具有统计学意义.且二者的R2值分别为0.998 2、0.999 6，都接近1，可见模型与试验呈现出高度拟合状态.失拟项通常用以评估方程的可靠性，若不显著则方程模拟的较好，反之较差，酒精度（Y1）和感官评分（Y2）的失拟项均 >0.05，均为不显著，由此可应用本试验所得拟合回归方程来替代试验真实点对枸杞发酵过程中酒精度和感官评分进行推测和分析.根据回归模型显著性结果显示：对于酒精度（Y1），一次项和二次项均为极显著，其影响酒精度的强弱程度为：B>C>A；交互项BC具显著性，其余为不显著，则能够说明B、C两者之间的交互作用显著，因此，在采用该拟合回归方程模型时应考察二者之间的交互作用.对于感官评分（Y1），一次项C不显著，其余均为极显著，二次项又均为极显著性，其影响酒感官评分的强弱程度为：A>B>C；交互项AB、AC间交互作用极显著，由此在应用该模型时需要考虑到AB、AC间的交互作用.

2.3 响应面三因素交互作用分析

响应面图能直观地反映出两因素之间的交互作用的大小，其倾斜度程度越大，且对应的等高线图愈接近椭圆形，说明两个因素之间的交互作用越显著［20］，对响应值的影响程度越大；反知当曲面图的坡度越平缓，对应的等高线越近似于正圆形，则说明这两个因素之间的交互作用就越弱，对响应值的影响程度越小.由图6可见，AB、BC间响应面图的等高线均近于椭圆形，相较而言BC间曲面图的倾斜程度更大；AC间曲面图较为平缓，其等高线接近正圆形.结合表4方差分析的结果可知，各交互作用中的F值分别为AB=AC=4.83，BC=10.86，综上，影响枸杞发酵的酒精度的各因素之间的交互作用大小为BC>AB>AC.

图6 三因素交互作用对枸杞发酵液酒精度的影响Fig.6 Interaction of the three factors on the alcohol content of Lycium barbara fermented liquor

由图7可知，AB间响应曲面坡度最为陡峭，且等高线近似于椭圆形，其次AC间曲面倾斜度较高；而BC曲面图最为平缓，且等高线近正圆形.据表4 可得，两两因素交互作用对应的F值分别为AB=10.86，BC=43.45，AC=1.21，故而影响枸杞发酵的感官评分的各因素之间的交互作用大小为AB>AC>BC.

图7 三因素交互作用对枸杞发酵液感官评分的影响Fig.7 Interaction of the three factors on the sensory evaluation of Lycium barbara fermented liquor

3 验证试验

在单因素试验基础上，确定枸杞发酵最佳的液料比为20：1 和pH 为5.0.结合响应面试验进行优化分析，确定了枸杞发酵液的最佳发酵参数分别为发酵时间5.5 d、发酵温度为31.17 ℃、接种酵母质量分数为1.56%.实际操作中，将各参数条件进行略微调整，实际参数条件及5 次重复验证试验，试验结果见表5.

表5 参数优化后枸杞发酵液酒精度与感官评分值Tab.5 The alcohol content and sensory score of Lycium barbara fermented liquor after parameter optimization

优化发酵条件下，回归模型所预估的发酵液酒精度为2.56%vol，感官评分为76.3 分；而实际试验条件下，5 次重复试验所得到的酒精度与感官评分平均值分别为2.53%vol 和79.7 分.这与回归方程所得的酒精度与感官评分预测值较接近，表明该回归方程与实际情况拟合度高，能够比较准确真实地反映各因素对枸杞发酵液酒精度与感官评分的影响.

4 结论

本研究以枸杞为原料，基于单因素试验探究五因素对枸杞微生物发酵（酵母菌）的影响，并以响应面分析法加以优化，确定了枸杞发酵制备的最优参数为：发酵时间5.5 d、发酵温度为31 ℃、接种酵母质量分数为1.6%.在结合液料比20：1、pH5.0条件下，重复进行5次验证试验，所测得的实际酒精度和感官评分均值分别为2.53%vol和79.7分，与回归方程所得的预测值，即酒精度2.56%vol与感官评分76.3分很接近，因此采用响应面法优化枸杞发酵工艺条件合理可靠，可为枸杞以及其他植物资源的果酒制备，实现综合利用提供一定的借鉴价值.