气相色谱-三重四极杆串联质谱法（GC-MS/MS）测定茶叶中19种邻苯二甲酸酯*

林柏纬

（福建省产品质量检验研究院，福建 福州 350002）

0 引言

我国作为茶叶之乡，自唐宋以来在国际上一直享有很高的声誉。福建茶种植悠久历史，拥有得天独厚的自然条件，作为国内重要茶产品供应地之一，福建茶自古就畅销国内外。然而，近年来随着经济不断地发展，茶叶产地不断扩大，茶叶质量安全事件也随之增加，进而严重影响了我省茶叶产业发展。其中环境污染物，特别是有机污染物中的邻苯二甲酸酯（Phthalate esters,PAEs）越来越受到专家学者们的重视[1]。

PAEs 是由邻苯二甲酸同醇发生酯化反应所产生的，有着无色、易挥发、难溶于水等特性。PAEs在全球产量大、应用面广，常作为一种增塑剂使用，且在我国的使用率高达84%[2]。PAEs被添加到塑料中，能使塑料材料具有更好的拉伸性和延展性，此外，部分还用作化妆品的定香剂等[3]。但由于PAEs与塑料材料之间连接不稳定（两者间由氢键或范德华力连接）[4-7]，从而使得其易发生迁移，虽急性毒性不大，但在体内积累会干扰人们体内激素的分泌，会对人体内的生殖系统造成伤害以及导致体内激素分泌功能失调、免疫力功能减退、儿童性早熟、心血管疾病、肝脏和其他泌尿系统伤害等[8-11]。近年来“塑化剂”事件层出不穷，如2011年产生恶劣影响的台湾“塑化剂”事件，“起云剂”被用于一些食品的生产和加工中，“起云剂”中含有化学成分酞酸双(2-乙基己基)酯（DEHP）对人体有害，“起云剂”的添加导致大量的食品受到污染。

目前常见的检测方法有液相法（HPLC）[12-14]、液-质法[15]、气相法（GC）[16-17]、气-质法（GCMS）[17-21]、气-质-质法（GC-MS/MS）[22-24]等。GCMS/MS相较其他方法具有高速、高效分离的特点，同时还具有提高效率、缩短检测周期，准确定性，降低检测成本等优点。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

正己烷(色谱级，回流重蒸），丙酮色（色谱级，回流重蒸），二氯甲烷(色谱级，回流重蒸)；MIPs/SPE (CNW BOND，0.1 g/mL，德国CNW公司)；MgSO4（分析纯，西陇化学试剂有限公司）；PSA[粒度4 μm，技尔（上海）商贸有限公司]；MWCNTS(粒径5 nm，天津博纳艾杰尔科技有限公司)；19种PAEs基本信息（见表1）。

表1 19种PAEs基本信息

1.2 仪器与设备

气质联用仪（美国Agilent公司，Agilent 7000D）；高速冷冻离心机（Sigma公司，SIGMA 3-18KS）；超声波振荡器(日本avio,SW-D600S-48)；旋涡混匀器（德国IKA公司，MS 3 basic）；K600粉碎机(德国Braun)。

1.3 实验方法

1.3.1 溶液配制

标准储备液的配制：使用移液管移取1 mL的19种邻苯二甲酸酯（PAEs）混合标准品（浓度为100 μg/mL），定容到25 mL（定容溶剂为正己烷），获得4 μg/mL的标准储备液，冷藏保存。

标准工作溶液的配制：从标准储备液中逐级稀释，得到0.005、0.01、0.05、0.5、2.5 μg/mL的标准工作溶液。

1.3.2 前处理步骤

将25 g茶叶粉碎成均匀粉末，取2.50 g粉末放入离心塑料管中，加入10 mL正己烷，超声震荡提取30 min。以12000 r/min的速率离心5 min，收集上层清液，将清液氮吹至近干，用正己烷定容至2.0 mL，涡旋混合后待净化。

依次使用正己烷(色谱级）及二氯甲烷(色谱级)活化MIPs/SPE柱，然后加入3 mL正己烷。取上述复溶清液至活化好的分子印记柱内净化，等待液面缓慢下降至最低处，然后用5 mL二氯甲烷淋洗柱子，再用5 mL二氯甲烷洗脱，将洗脱的液体氮吹至近干，用正己烷定容到1.0 mL，涡旋混匀，然后将混合液转移至进样瓶中，等待进行气质联用仪测定。

1.3.3 仪器条件

色谱柱选择：DB-5ms 低流失气相色谱柱（规格：长度30 m，内径0.25 mm，膜厚度0.25 μm）。

进样口温度：260 ℃，升温模式为程序控制，进样方式采取不分流进样，到分流出口吹扫流量60 mL/min，吹扫时间1 min；进样量1 μL，载气流量1 mL/min。程序升温设置详见表2。

表2 升温程序

离子源参数：EI(电子轰击型离子源)，源温度280 ℃；电子能量70 eV；传输线温度290 ℃，碰撞气为氮气；溶剂延迟时间4.5 min；MRM模式。质谱参数见表3。

2 结果与分析

2.1 前处理条件的选择

QuEchERS 提取效率主要受溶剂种类、浓度等因素影响[25]。

⑴ 溶剂种类——不同溶剂的极性和溶解度不同，会对PAEs的提取效率产生影响。极性较高的溶剂可以更好地溶解PAEs，从而提高提取效率。常用的提取溶剂正己烷、丙酮或者二氯甲烷等[26]。我们按照前面方法处理了不含PAEs的茶样，并进一步加入了0.100 mg/kg的混合标准溶液，测得各种PAEs的回收率平均值（见表4），实验结果表明正己烷的提取回收率最高，且在实验中发现丙酮和二氯甲烷提取液中含有大量色素杂质，颜色较深。

表4 提取条件对平均回收率的影响

⑵ 提取温度——提取的温度也会影响PAEs的提取效率。溶剂浓度越高，提取效率也会相应提高。

⑶ 提取时间——提取时间也会影响PAEs的提取效率。时间过短可能会导致提取不充分，时间过长回收率增长不明显。实验发现正己烷提取时间为10、30、60 min时，回收率分别为81.9%、93.7%、97.2%。

综合上述因素，故选用正己烷作为提取溶剂。

2.2 净化条件的选择

文献报道中QuEchERS净化方法和固相萃取净化法较为常见，有机酸、茶多酚和儿茶素类物质能够被PSA有效去除，但PSA去除非极性物质效果不好，例如脂肪类物质、色素以及维他命类化合物等。此外，添加多壁碳纳米管、弗罗里硅土和石墨化碳都可以吸附色素类物质，其中多壁碳纳米管在色素吸附方面的效果最为优秀，但实验过程中尝试使用弗罗里硅土、C18、乙二胺基-N-丙基、多壁碳纳米管、石墨化碳等填料进行净化[27]。结果表明，若未使用多壁碳纳米管和石墨化碳，对样品中的大量色素杂质的去除效果很差，且在使用多壁碳纳米管和石墨化碳的情况下，19种PAEs的无法得到一个满意回收率，因此QuEchERS净化法不适用于净化19种PEAs提取液。经过综合考虑，我们选择了CNWBOND分子印迹固相萃取净化法[21]。实验结果表明，19种PAEs的平均回收率区间为80%～102.4%，且净化效果良好。分子印迹-固相萃取法对目标化合物的特异选择性强，对于茶叶这种基质相对复杂的提取液，能够很好地从中分离出PAHs，同时具有较强的富集能力，能吸附低浓度的目标化合物[2]。

2.3 质谱条件的选择

根据欧盟2002/657/EC指令规定，质谱确证方法必须达到4个定性点（一个质谱离子为一个确证点），低分辨GC-MS除了确定母离子，还需要2个以上的子离子，在识别出PAEs的母离子后，对子离子进行全扫描（Full Scan）分析二级质谱。我们选取了2个丰度较强的离子，将其作为定量子离子；丰度弱一点的离子，用于协助定性。

为提升质谱的分析效果，通过调整CE（碰撞能量）、电子能量、Resolution（分辨率）等质谱参数进行优化调节，确保PAEs的特征离子对强度达到最大。为优化质谱的参数，母离子的选择是基于丰度高和质量数大的离子，因此对19种目标化合物进行Full Scan。经查阅相关文献[16]，此原理在50～500质荷比(m/z)的范围内能较好地选择最佳的监测离子和碰撞能量，有助于消除杂质的干扰。在选定的色谱条件下，通过全扫描的方式，得到加标浓度为0.10 mg/kg的基质加标样品提取溶液的19种PAEs总离子流（TIC）色谱图（图1），目标化合物之间基本不存在干扰且采集的灵敏度高。

图1 EI-MRM总离子流色谱图

2.4 线性范围与相关系数

基质匹配标准溶液和纯溶剂标准溶液的工作曲线浓度为0.005、0.010、0.050、0.250、2.500 mg/L，目标物的质量浓度(X,mg/kg)和峰面积（Y）分别为线性回归方程的横坐标和纵坐标，得到19种PAEs的线性方程Y=aX-b，常数a和b相关系数、检出限及定量限见表5，相关系数(r)在0.9989～0.9999范围内，线性相关性强。因此，在标准曲线线性范围内，19种目标物化合物线性较好，计算得到检出限在0.0001～0.002 mg/kg范围内（3倍的信噪比，按称样2.50 g，定容1.0 mL）。

2.5 方法的准确度和精密度

经过优化后以绿茶空白样品为基质，进行加标回收试验，加标回收浓度水平为0.020、0.100、0.500 mg/kg，每个水平做3个平行，得到的结果见表6。在不同水平添加条件下，19种PAHs的加标回收率在89.4%～109.2%区间，相对标准偏差为1.6%～7.2%，可以看出该方法有着良好的准确度和精密度。

表6 绿茶样品在0.020、0.100、0.500 mg/kg加标水平下19种PAEs的回收率和精密度

2.6 实际样品分析

使用本文建立的检测方法对70份茶叶样品中的19种PAEs进行了测定，样品包括寿眉、贡眉、铁观音、茉莉花茶、乌龙茶、正山小种等常见茶叶，结果发现所有样品均检测出含有PAEs（见表7），表明茶叶中存在一定的PAEs污染，19种PAEs的平均含量范围为4.7～841.2 μg/kg，这说明不同PAEs化合物的含量存在差异。因此，可以认为PAEs污染在茶叶中是普遍存在的，应该引起足够的重视和关注。

表7 实际样品中PAEs的检出率、最小值、最大值和平均值

3 结论与讨论

本研究建立了茶叶中19种多环芳烃的气相色谱-三重四极杆串联质谱法(GC-MS-MS)。采用超声提取和MIPs/SPE净化的方式进行样品前处理，可以有效地提高同时处理样品的批次数，极大地缩短了试验时间，且能得到准确的定量结果。总之，该方法具有试验时间短、灵敏度高和定量准确等优势，对加强市场茶叶监管，提升茶叶品质水平，保障消费者食品安全等都有着积极促进作用。