贵州林下生态养鸡场环境的野生动物及其肠道微生物群落调查

2024-03-01张人俊刘显明张中义刘妍罕温贵兰

贵州畜牧兽医 2024年1期

张霞, 王慧, 张人俊, 刘显明, 张中义, 刘妍罕, 杨颖, 温贵兰, 文明

(1. 贵州省动物疫病预防控制中心,贵州贵阳 550008;2. 威宁自治县动物疫病预防控制中心,贵州威宁 553100;3. 罗甸县养殖业发展中心,贵州罗甸 550100;4. 贵州大学动物疫病研究所,贵州贵阳 550025)

贵州省是我国生态环境较好的省份之一,林下生态家禽养殖是全省畜牧产业的重要发展方向。林下生态养殖家禽容易接触到野生动物,而这些野生动物是自然界中病毒、细菌和寄生虫等病原的天然宿主,容易传染林下养殖的家禽,使家禽感染发病而造成经济损失。本研究于2019年9月1日至2022年8月30日在贵州省具有区域代表性的毕节市威宁自治县和黔南自治州罗甸县开展林下生态养鸡场环境野生动物及其肠道微生物群落调查,以期为林下生态养鸡场的疫病防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 检测样品

野生动物采自威宁自治县和罗甸县2个具有区域代表性的生态养鸡场周围环境,采用颈椎错位法处死后采集肠道样品,于8 ℃左右保温箱中保存并及时送至贵州大学动物疫病研究所,置于 -83 ℃冰箱保存备用。

1.2 主要试剂

细菌基因组DNA提取试剂盒、SanPrep-DNA凝胶提取试剂盒、QIAamp Viral MinElute Virus Spin Kit、QIAamp Viral MinElute Virus Spin Kit、SuperScript Ⅲ Reverse Transcriptase Kit、Nextera XT DNA Sample Preparation Kit(96 Samples),均购自Sangon Biotech公司。

1.3 主要仪器

台式高速离心机(型号:Centrifuge 5418R,德国Eppendorf公司)、PCR仪(型号:MyCycler,美国Bio-Rad公司)、QIAxtractor(型号:SN002358,德国QIAGEN公司)、NanoDrop(型号:L200,美国Thermo Fisher公司)、Bioanalyzer(型号:L2100,美国Aglient公司)、酶标检测仪(型号:Epoch,美国BioTeK公司)、Illumina PE 150测序平台(型号:Miniseq,美国Illumina公司)。

1.4 野生动物种类调查

1.4.1 鸟类调查

根据养鸡场周围环境情况和鸟类生活习性,采用样线法和网捕法相结合,每个养鸡场选择2条样线,每条样线长约3 km,每条样线每季度观察1次和设立网捕1次,调查期1年。观察时选择晴朗天气,时间分别为7:00～10:00、15:00～17:00,使用Bushnell 8×42倍望远镜和Cannon数码照相机以约1.0 km/h 速度沿样线活动,观察和拍照样线两侧50 m 内的鸟类。网捕时选择大小10 m×2.6 m、网孔2 cm的雾网,每个养鸡场设置22张雾网,各季节位置相对固定,张网时网长轴方向随地势而定,网面与地面垂直,网下缘与地面距离不超过10 cm,每个季节张网5 d,每天早、晚各观察1次,收集捕获鸟。健康鸟采集泄殖腔样品并记录相关信息后放飞,濒死或死亡鸟鉴定其种类并收集其肠道内容物于 -83 ℃冰箱保存备用[1]。

1.4.2 鼠类调查

在养鸡场周围环境1 km范围内,采用夹板法(7 cm×17 cm木夹板),每30 m2左右设置1个木板夹。花生米做诱饵,晚放早收。每季度调查1次,每次调查5 d,调查期1年。对捕获的鼠类标本进行编号和属种鉴定,并收集其肠道内容物于 -83 ℃冰箱保存备用。

1.4.3 兔类调查

以养鸡场为中心,向东西南北4个方向设置调查样带,沿样带两侧仔细搜索和观察兔类的足迹、粪便、啃食痕迹、洞穴等情况,采用笼网法捕获野兔。每季度调查1次,每次5 d,调查期1年。对捕捉的野兔进行种类鉴定后处死并收集肠道内容物于-83 ℃冰箱保存备用。

1.5 野生动物肠道细菌群落调查

采用16S rRNA基因测序方法[2]:取保存的野鸟、野鼠、野兔肠道内容物样品,用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌总DNA,以通用引物(343F-5’-TACGGRAGGCAGCAG-3’;798R-5’-AGGGTATCTAATCCT-3’)扩增细菌16S rRNA,SanPrep-DNA凝胶提取试剂盒分离纯化并测定含量后,以TruSeq DNA试剂盒制备测序文库,送至Illumina公司使用Illumina Miseq测序仪进行高通量测序,使用Uparse(7.0.1090)软件分析细菌群落结构。

1.6 野生动物肠道病毒群落调查

采用病毒宏基因组学方法[3]:取保存的野鸟、野鼠、野兔肠道内容物样品,分别加入de DPBS 500 mL,反复剧烈振荡3次后低温超速离心(3 000 r/min,10 min),收集上清液,核酸酶充分消化后,用QIAamp Viral MinElute Virus Spin Kit提取病毒核酸,再用SuperScript Ⅲ Reverse Transcriptase反转录成 cDNA,用Nextera XT DNA Sample Preparation Kit(96 Samples)构建cDNA文库,再进行cDNA文库扩增、纯化和文库片段筛选,取符合条件的样品送至 Illumina 公司进行高通量测序,使用Ventoy软件(v1.0.94)进行解读和数据处理,分析肠道病毒群落结构。

2 结果与分析

2.1 野生动物种类

2个养鸡场环境观察或捕捉的野生动物包括鸟类、鼠类、兔类共计1 778只(见表1)。其中:鸟类1 388 只,隶属1目6科,包括雀形目雀科1个种63只、梅花雀科1个种237只、画眉科3个种824只、鹎科2个种152只、鸦雀科1个种39只、鸫科1个种73只;鼠类365只,隶属啮齿目鼠科;兔类25只,隶属兔形目兔科。优势野生鸟类主要是灰眶雀鹛、白腰文鸟、栗耳凤鹛、红头穗鹛,野生鼠类主要是黑线姬鼠,野生兔类仅发现华南兔。

2.2 野生动物肠道细菌群落

由表2可见:2个养鸡场环境中的野生动物肠道细菌群落有一定相似性,在门水平主要是拟杆菌门、厚壁菌门、变形杆菌门,在纲水平主要是拟杆菌纲、梭状芽孢杆菌纲、γ变形杆菌纲,在目水平主要是拟杆菌目、肠杆菌目、梭菌目,在科水平主要是拟杆菌科、肠杆菌科、毛螺菌科,在属水平主要是拟杆菌属、大肠杆菌属、梭菌属。这些环境野生动物肠道携带的细菌有可能污染林下生态养鸡场,导致鸡群感染发病。

2.3 野生动物肠道病毒群落

由表3可见:野鸟、野鼠、野兔肠道病毒种类均呈多样性,其中:野鸟肠道病毒群落主要是二顺反子病毒科、传染性软腐病病毒科、细小病毒科等,且存在与其食物习性有关的病毒,如鱼疱疹病毒科;野鼠肠道病毒群落主要是细小病毒科、乳头瘤病毒科、二顺反子病毒科等;野兔肠道病毒群落主要是二顺反子病毒科、细小病毒科、乳头瘤病毒科等。在这些野生动物肠道存在能够感染家禽的多种病毒,如细小病毒、冠状病毒、圆环病毒、疱疹病毒、痘病毒、腺病毒等。可作为林下生态养殖家禽病毒性疾病的重点诊断、预防和控制对象。

3 讨论

3.1森林植被特征影响野生动物种类组成与结构特征。良好的森林生态系统为生活的野生动物,如野鸟、野鼠、野兔等提供了丰富的营养基质。本次在林下生态养鸡场周围环境观察和捕获的野生动物中以野鸟最多,其中食虫鸟种类占捕获总数的70%以上。在威宁和罗甸2个林下生态养鸡场周围发现花果植物有一定量的分布,但食花果鸟类的捕获率并不高,原因可能与雾网的高度限制了对林冠层鸟类的捕获有关。在林下生态养鸡场环境捕获的野生鼠类中,仅有1目(啮齿目)1科(鼠科)4种(黑线姬鼠、黄胸鼠、褐家鼠、小家鼠),其中以黑线姬鼠为优势种,占捕获总数的45.88%,其次是黄胸鼠、褐家鼠、小家鼠,分别占24.45%、21.15%、8.79%,可能是由于贵州省气候条件、地形地貌、植被种类、生态景观的复杂多样性决定。本次捕获的野生兔类只有兔形目兔科华南兔1个种,捕获数量较少,未能体现生态养鸡场周围野生兔类群落分布特征。

3.2本次调查发现,野生鸟类肠道微生物种类繁多,主要包括变形菌、厚壁菌、拟杆菌、放线菌等,对于寄主鸟类的营养吸收、免疫、毒素降解和体温调节方面具有重要功能。如:植食性鸟类肠道微生物以拟杆菌和厚壁菌为主,同时常存在一些与免疫和解毒有关的共生菌。野生鼠类和野生兔类均属哺乳动物,虽在同一环境内,但肠道菌群的组成在门、属和OTU(操作分类单元)水平均有差异,这可能是由于二者属于不同物种,且食物结构和生活环境不同所致:野生鼠类主要栖息于地下,以植物根、皮、茎、叶、果实、种子为食,而野生兔类主要栖息在地上,以植物叶茎、花、根、芽为食,较少摄入种子。可见野生动物种类、饮食及生活环境差异可能导致其肠道菌群组成也有差异。

3.3林下生态养鸡场环境野生动物肠道病毒群落也存在不同程度的差异。野生鸟类肠道病毒群落主要涉及16科,包括二顺反子病毒科、传染性软腐病病毒科、细小病毒科、未分类RNA病毒等;野生鼠类肠道病毒群落主要涉及27科,包括细小病毒科、乳头瘤病毒科、二顺反子病毒科、未分类病毒等;野生兔类肠道病毒群落主要涉及19科,包括二顺反子病毒科、细小病毒科、乳头瘤病毒科、未分类病毒等。野生鸟类以无脊柱动物病毒来源为主,而野生鼠类和野生兔类以脊柱动物病毒来源为主,推测这些不同种类野生动物肠道病毒群落分布与其生活环境和进食习惯也有密切关联,即野生鸟类喜群居,在池塘、湖边以进食鱼、虾、蟹为食,导致肠道病毒群落以水生动物病毒为主,而野生鼠类和兔类在栖息地与其他陆生动物存在密切接触,导致肠道病毒群落以陆生动物病毒为主。