兔抗LGALS1蛋白多克隆抗体的制备

代 丹, 姬格金, 郑维豪, 张煜杭, 罗 芬, 陆 建, 鲜思美,2*

(1. 贵州大学动物科学学院,贵州 贵阳 550025;2. 贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室,贵州 贵阳 550025)

羊口疮病毒(ORFV)能引起羊的口、唇、舌、鼻、乳房等部位皮肤和黏膜形成丘疹、脓疱、溃疡、疣状厚痂,是1种接触性、嗜上皮性、人兽共患传染病,在世界范围内均有发生,严重威胁养羊业[1,2]。F1L蛋白是ORFV的囊膜蛋白,是病毒表面微管的组分之一,在病毒入侵宿主的过程中起关键作用[3]。宿主细胞蛋白半乳糖凝集素1(LGALS1)与F1L蛋白互作可能是ORFV感染的重要原因。本试验通过制备兔抗LGALS1多克隆抗体,为研究LGALS1蛋白在ORFV的感染和增殖中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 LGALS1蛋白和实验动物

LGALS1蛋白由本实验室制备并保存。健康新西兰大白兔2只(雄性、6月龄、体重3.5 kg)及饲料均购于贵州鹏程农业科技有限公司。

1.2 主要试剂和仪器

聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)快速配制试剂盒、辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔IgG、异硫氰酸荧光素(FITC)标记山羊抗兔IgG(H+L)、特超敏电化学发光(ECL)试剂盒、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂、抗荧光淬灭封片液(含DAPI),均购自碧云天生物技术有限公司;彩虹180广谱蛋白预染Marker(11～180 kDa)、0.45 μm聚偏二氟乙烯膜(PVDF),均购自Solarbio公司;电泳仪(型号:EPS300)、凝胶成像仪(型号:Tanon-1600),购自Tanon公司;倒置荧光显微镜(型号:BDS400),购自CNOPTEC公司。

1.3 兔抗LGALS1蛋白多克隆抗体的制备

按LGALS1蛋白0.8 mg/只剂量与佐剂以1∶1体积比乳化,背部皮下多点注射免疫新西兰大白兔,共免疫3次,每次间隔14 d。第1次免疫采用弗氏完全佐剂,第2、3次免疫采用弗氏不完全佐剂。第3次免疫后第7 d心脏采血,分离血清,-80 ℃冻存。

1.4 多克隆抗体效价测定

以LGALS1蛋白(10 μg/mL)每孔100 μL包被ELISA板,4 ℃过夜,磷酸盐吐温缓冲液(PBST)洗涤3次,5%脱脂奶粉每孔200 μL,37 ℃封闭2 h,PBST洗涤3次,分离血清倍比稀释(1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600、1∶51 200、1∶102 400、1∶204 800、1∶409 600)加入酶标板,每孔100 μL,37 ℃孵育1 h,PBST洗涤3次,二抗HRP标记的山羊抗兔Ig G 1∶4 000倍稀释,每孔100 μL,37 ℃孵育1 h,PBST洗涤3次,再加入显色液每孔100 μL,37 ℃避光显色15 min,加入终止液50 μL终止显色,酶标仪测定D450 nm值。

1.5 多克隆抗体的Western blot分析

10%SDS-PAGE电泳,LGALS1蛋白转印PVDF膜,5%脱脂奶粉室温摇床封闭2 h。以分离血清(1∶500稀释)为一抗孵育PVDF膜,4 ℃过夜,Tris-HCl吐温缓冲盐溶液(TBST)洗涤3次,15 min/次,以HRP标记的山羊抗兔IgG(1∶1 000稀释)为二抗,室温孵育1 h,TBST洗涤3次,15 min/次,加ECL显色液100 μL显色。

1.6 多克隆抗体的验证

将羔羊睾丸细胞(LT)接种至12孔细胞板,待细胞汇合度达到60%后弃掉原培养基,磷酸盐缓冲液(PBS)润洗,4%多聚甲醛4 ℃固定30 min;0.5%Triton X-100穿孔10 min,5%牛血清白蛋白(BSA)室温封闭30 min。以1∶200稀释比的分离血清为一抗,4 ℃孵育30 min;以FITC标记的山羊抗兔IgG(H+L)为二抗(1∶200稀释),37 ℃避光孵育1 h,DAPI孵育15 min(细胞核染色)。同时设置阴性对照(PBS为一抗)。荧光显微镜分析LGALS1蛋白表达情况。

2 结果与分析

2.1 多克隆抗体的效价

以纯化LGALS1蛋白为抗原,利用间接ELISA法测定LGALS1蛋白多克隆抗体的效价,当阳性对照孔(P)与阴性对照孔(N)的D450 nm比值≥2.1时,其血清的最高稀释度为多克隆抗体的最高效价。由表1可见:稀释比为1∶102 400时,P/N值为3.778(>2.1);稀释比为1∶204 800时,P/N值为2.0(<2.1)。因此多克隆抗体的效价为1∶102 400。

2.2 多克隆抗体Western blot分析

由图1可见:35 ku LGALS1蛋白处有特异的单一条带,LGALS1蛋白多克隆抗体能特异性识别LGALS1蛋白。

1:蛋白Marker;2:B2L蛋白;3～5:LGALS1蛋白

2.3 多克隆抗体的验证

由图2可见:间接免疫荧光分析表明,LT细胞质中有特异绿色荧光,兔抗LGALS1多克隆抗体可有效识别LT细胞中的LGALS1蛋白。

FITC:绿色荧光LGALS1蛋白;DAPI:蓝色荧光细胞核;Merge:DAPI和FITC的叠加组合

3 结论

本试验成功制备了兔抗LGALS1蛋白多克隆抗体,抗体特异性好,效价高。

4 讨论

4.1免疫佐剂是抗体制备成功与否的重要因素,适当的免疫佐剂毒副作用较低,免疫效果好,可提升抗体的亲和力和特异性。弗氏佐剂是目前最常用的免疫佐剂,包括含结核分枝杆菌的弗氏完全佐剂、不含结核分枝杆菌的弗氏不完全佐剂。弗氏不完全佐剂主要成分为油剂和乳化剂,与抗原完全混合后形成油包水乳液,缓慢释放抗原,可刺激机体稳定、长期产生抗体。弗氏完全佐剂添加了灭活的结核分枝杆菌,免疫反应更强,但可导致注射部位局部肉芽肿、炎症等不良反应,仅适用于初次免疫。2种佐剂的联合使用可避免弗氏完全佐剂的副作用,同时又能产生高效价抗体。

4.2免疫原、佐剂乳化程度、免疫方式对抗体的产生及效价也有很大影响。本试验采取常用的注射器乳化法,该方法通过注射器来回抽吸使抗原充分乳化,形成油包水状态。注射器乳化虽然耗时费力,但易于实现无菌操作,且抗原损失较少,适合少量抗原的处理。此外,本试验采用皮下多点注射的免疫方法,可在动物多个身体部位长时间持续刺激,获得较高的抗体效价。