禽腺病毒4型GZ-B1毒株的Hexon基因序列分析

罗青华, 罗东还, 温贵兰, 徐 飞

(贵州大学动物科学学院,贵州 贵阳 550025)

禽腺病毒(Fowladenovirusserotype,FAdV)是腺病毒科、禽腺病毒属、呈球形的双股线性DNA病毒,无囊膜,直径60～90 nm[1],分为 Ⅰ 、 Ⅱ 、 Ⅲ 群。Ⅰ 群禽腺病毒分为5个亚群(A、B、C、D、E)和12个血清型(1～8a、8b～12)[2],其中FAdV-4属于C亚群、血清4型。FAdV 由252个壳粒蛋白组成,其中240个非顶角壳粒组成大部分的结构蛋白表壳,又称六邻体(Hexon),其余为12个顶角壳粒称五邻体(Penton),并有2根纤突蛋白(Fiber)通过五邻体伸出[3]。六邻体是1种伪六边形三聚体,位于20面体衣壳的20个面上,分为H1、H2、H3、H4共4种六邻体。相关研究表明,Hexon基因高度保守,并携带主要的属和亚属特异性抗原决定簇和次要的种特异性抗原决定簇,因此该基因能准确区分FAdV的血清型[4]。1987年禽腺病毒病首次在巴基斯坦安加拉哥特发生,因此也被称为安卡拉病,随后相继在印度、科威特、韩国等国家暴发[5]。2007—2013年该病在我国以散发为主,2015年6月以来,由FAdV-4引起以心包积液为特征,伴随肝脏肿大的鸡疫病流行于我国山东、河南等省份的部分地区[6]。2016年贵州省首次报道该病,随后有多个养鸡场报道出现疑似病例,多地呈现局部流行的趋势[7,8]。本试验通过对贵州分离的FAdV-4毒株(GZ-B1株)Hexon基因进行扩增、克隆和序列测定,分析其与国内外流行毒株之间的遗传进化关系,探究FAdV的遗传变异情况,为该病的防控和疫苗制备提供参考。

1 材料与方法

1.1 毒株来源

FAdV-4 GZ-B1株,保存于贵州大学动物科学学院实验室。

1.2 主要试剂

pMD19-T载体、大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞[购自宝生物工程(大连)有限公司],2×TaqPCR Master Mix、胶回收试剂盒、DL 2 000 DNA Marker、病毒核酸提取试剂盒(购自上海生工生物有限公司),培养基配制所需的胰蛋白胨、琼脂粉等(购自北京索莱宝科技有限公司)。

1.3 主要仪器

PCR扩增仪(型号:T-20,杭州朗基科学仪器有限公司)、台式高速冷冻离心机(型号:TGL-M18,上海卢湘仪离心机仪器有限公司)、电泳仪(型号:DYY-8C),北京市六一仪器厂)、高压蒸汽灭菌锅(型号:BXM-30R,上海圣科仪器设备有限公司)。

1.4 引物设计与合成

根据GenBank中FAdV-4基因序列(登录号:GU188428.1),使用Primer Premier 5.0软件设计Hexon基因特异扩增引物,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物信息见表1。

1.5 Hexon基因PCR和克隆

按照病毒核酸提取试剂盒说明书方法提取GZ-B1株核酸。以提取的病毒核酸为模板,使用合成引物进行目的基因PCR扩增。PCR反应体系20 μL:2×TaqPCR Master Mix 10 μL,模板DNA 2 μL,ddH2O 6 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL。扩增程序:95 ℃ 5 min;95 ℃ 1 min, 58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共35个循环;72 ℃ 10 min,4 ℃保存。用1.2%琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳,胶回收。回收产物与pMD19-T载体连接,转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中培养2 h,涂布接种于含有氨苄西林(50 μg/mL)的LB固体培养基,37 ℃培养12 h,挑取单菌落增菌培养12 h,通过菌液PCR筛选出克隆成功的阳性菌液。将鉴定为阳性克隆质粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.6 Hexon基因遗传进化分析

将克隆获得的基因序列拼接后进行BLAST比对,用DNAStar将分离毒株的Hexon基因序列分别与GenBank中13株不同亚群FAdV-4参考毒株进行同源性比较,运用MEGA 6.0构建系统发育树。参考毒株信息见表2。

2 结果与分析

2.1 Hexon基因PCR与克隆结果

GZ-B1株PCR扩增在327 bp处出现特异扩增条带(见图1),与预扩增片段相符。PCR产物T-A克隆菌液PCR鉴定显示克隆成功(见图2)。

M:DL 2 000 DNA Marker;1:GZ-B1株;-:阴性对照

M:DL 2 000 DNA Marker;1～3:克隆菌液;-:阴性对照

2.2 Hexon基因的遗传进化情况

由图3可见:GZ-B1株与FAdV基因型C、血清4型的7株参考毒株同源性较高(95.8%～98.5%),其中与国内强毒株GDMZ、LC1611、SDSG、SDXL相似度最高,均达到98.5%。GZ-B1株与基因型A、B、D、E的6株参考毒株同源性较低(73.3%～77.5%)。由图4可见:GZ-B1株与国内外基因型C毒株处于同一进化分支,且与血清4型亲缘关系最近,与A、B、D、E基因型处于不同进化分支。GZ-B1株与国内强度株FAdV-C LC1611的遗传亲缘关系最近,表明GZ-B1株属于C基因型、血清4型禽腺病毒。

图3 GZ-B1株与参考毒株的核苷酸序列同源性

图4 GZ-B1株遗传进化树

3 结论

本研究结果表明,FAdV-4 GZ-B1分离株属于C基因型、血清4型,与国内流行的强毒株FAdV-C LC1611亲缘关系最近,同源性最高。

4 讨论

4.1FAdV-4Hexon基因编码937个氨基酸,其开放阅读框长度2 811 bp,包含种和属的抗原决定簇,推测可能与致病性有关[9]。近年来,FAdV-4在国内的流行范围持续扩大,导致养殖肉鸡和种鸡批量死亡、种蛋质量下降,造成重大经济损失。相关研究表明,FAdV-4灭活疫苗可对FAdV的多种血清型提供交叉免疫防护[10]。深入研究FAdV-4的致病机制和免疫方法对有效防控 FAdV-4感染具有重要意义。

4.2不同地区FAdV分离毒株有不同程度变异和致病性上的差异。本研究对贵州分离的FAdV-4 GZ-B1毒株进行Hexon基因克隆及测序,发现其与国内强毒株LC1611同源性最高,亲缘关系最近,推测二者可能来源一致,可为追踪该分离株的传播来源提供依据。此外,GZ-B1株与国内强毒株GDMZ、SDSG、SDXL处于同一进化分支,同源性高;而国外弱毒株KR5、ON1也在同一进化分支,同源性稍低,且报道时间在中国之前。推测GZ-B1株是从国外传入后毒力增强,并从疫区省份传播至贵州。进一步了解该分离毒株的遗传进化情况,可为FAdV-4的流行病学调查及防控提供参考。