鸽微RNA病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

2024-03-01张靖鹏陈翠腾付环茹李兆龙万春和

畜牧兽医学报 2024年2期

张靖鹏,陈翠腾,林琳,付环茹,李兆龙,江斌,黄瑜,万春和

(福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省禽病防治重点实验室/福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心,福州 350013)

根据国际病毒分类委员会(The International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV)[1]的分类,微RNA病毒属(Megrivirus)属于小核糖核酸病毒科Kodimesavirinae亚科,微RNA病毒属有5个病毒种(Species),分别为微RNA病毒A型、微RNA病毒B型、微RNA病毒C型、微RNA病毒D型和微RNA病毒E型。

Megrivirus在一些患病的禽类中被鉴定,如在患火鸡病毒性肝炎的火鸡肝、肠道和泄殖腔拭子中均检测到Megrivirus[2],但其对宿主是否致病及致病力如何尚未见相关报道。2013年,Phan等[3]在匈牙利与中国香港地区的野鸽粪便中均发现存在Megrivirus,将其命名为鸽微RNA病毒(pigeon megrivirus,PiMeV)(MeV-B1株和MeV-B2株),ICTV根据其基因特点将其划入微RNA病毒B型,但未见进一步研究报道。

微RNA病毒是一类单股正链RNA病毒,无囊膜、呈球形、直径20～30 nm。病毒基因组大小为6 000～9 700 bp[4],多数含有一个大的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码一个大的多聚蛋白(polyprotein)。多聚蛋白一般由结构蛋白P1和2个非结构蛋白(P2和P3)组成。结构蛋白P1在蛋白酶的作用下分解为4种衣壳蛋白:VP1、VP2、VP3和VP4。P2和P3分解为7种非结构蛋白:2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D[5]。本研究根据GenBank中PiMeV代表株(MeV-B1株和MeV-B2株)序列特征设计检测引物,从1例腹泻综合征信鸽粪便中检测到PiMeV阳性(命名为PiMeV-CHN001株),为中国大陆地区信鸽群中首次发现该病。随后基于3C基因特征,建立检测PiMeV的实时荧光定量RT-qPCR方法,为后续开展PiMeV流行病学调查奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 毒株和菌株

鸽源禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)、鸽源禽I型副黏病毒(pigeon paramyxovirus type I,PPMV-1)、鸽输血传播病毒(pigeon torque teno virus,PTTV)、鸽腺病毒(pigeon adenovirus,PiAd)及鸽圆环病毒(pigeon circovirus,PiCV)[6-8]均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所鉴定并保存。

1.2 主要试剂与耗材

实时荧光定量试剂盒qPCR SuperMix Universal购自赛默飞(Thermo Fisher)公司;病毒核酸提取试剂盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit、脱氧核糖核酸酶I(DNase I)、反转录试剂盒 Reverse Transcriptase、PCR扩增试剂盒2×TransTaq-T PCR SuperMix和T克隆载体试剂盒pEASY-T1 Simple Cloning Kit、胶回收试剂盒Quick Gel Extraction Kit和质粒小量提取试剂盒Plasmid MiniPrep Kit均购自北京全式金生物技术有限公司;荧光定量八排管(PCR-0208-C)购自爱思进(Axygen)公司;其他常规化学试剂和耗材,均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 目的基因的克隆

1.3.1 序列扩增参考GenBank上登录的PiMeV代表株3C基因保守序列特征设计特异性检测引物组(PiMeVF1和PiMeVR1,引物序列:PiMeVF1:5′-GAGCRACCTTYCTTGGCTTTATC-3′,PiMeVR1:5′-TTCAAGTTCTTTCCAKGCYTTCTG-3′),预期扩增片段长度974 bp。

向信鸽粪便中加入灭菌PBS(体积比为1∶3)混匀,反复冻融3次,4 000 r·min-1离心20 min,吸取上清液,利用EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取病毒总RNA后将其反转录为cDNA,对其进行目的基因扩增,对RT-PCR产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定后克隆测序。

1.3.2 序列分析将3C基因测序结果在NCBI上进行BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)分析,并和数据库中的其他微RNA病毒进行分析比较,并绘制其遗传进化关系[9]。本研究使用的毒株信息见表1。

表1 本研究涉及到的毒株信息

1.4 实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

1.4.1 引物设计根据“1.3”中3C基因设计特异性的RT-qPCR的引物,引物序列:Mes2-1F:5′-CCCACTTCTGTCCCTGAATAAG-3′;Mes2-1R:5′-CCAGGGCAAGGTCTTCTTTAT-3′,预期片段大小为110 bp。

1.4.2 标准曲线的建立以“1.3”中含有3C基因的阳性质粒(命名为T-3C)为本研究的阳性标准品。利用微量核酸测定仪测定其浓度后,换算成拷贝数(5.4×1010拷贝·μL-1),进行10连续倍比稀释后备用。按照荧光定量试剂盒说明书配制20 μL的实时荧光定量RT-PCR反应体系,在不同引物终浓度(0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 μmol·L-1)对退火温度(56、58、60和62 ℃)进行反应条件优化。反应结束后,用优化后的反应条件进行扩增,获得扩增动力学曲线。以标准品起始拷贝数(5.4×101～5.4×106拷贝·μL-1)的常用对数(log quantity)为横坐标,以循环数阈值(cycle threshold,Ct值)为纵坐标,绘制出RT-qPCR反应的标准线性回归方程(标准曲线)。

1.4.3 特异性、敏感性和重复性试验用优化后的RT-qPCR反应条件分别对鸽常见的病原(如AIV、PPMV-1、PTTV、PiAd和PiCV)进行检测,评价建立方法的特异性。以连续倍比稀释的质粒标准品为模板,进行RT-qPCR反应,确定最小检测限。用建立的实时荧光定量RT-PCR方法分别对标准品质粒(含量为5.4×102、5.4×104、5.4×106拷贝·μL-1)进行检测,每种标准品含量重复3次,计算批内(intra-group)变异系数。分别将上述标准品分装后置于-20 ℃保存,每隔7 d取出,共检测3次,计算批间(inter-group)变异系数。

1.5 临床样品检测

对临床收集的42份信鸽粪便,按照“1.3.1”进行处理后,用本研究建立的RT-qPCR检测方法和常规RT-PCR方法平行检测,验证两种检测方法之间的符合率。

2 结果

2.1 3C基因序列分析

使用特异性引物对(PiMeV1/ PIMeVR1)扩增出约974 bp的目的条带,含有完整3C基因编码区,其中3C基因全长为591 bp,编码197个氨基酸。通过序列检索发现PiMeV存在半胱氨酸蛋白酶((cysteine protease)的特征基序为GFCG。核苷酸相似性分析可见,PiMeV-CHN001株与GenBank中其他2株野鸽源PiMeV(MeV-B1株和MeV-B2株)核苷酸同源率分别为89.5%和92.0%,氨基酸相似性分别为97.5%和99.5%。与Megrivirus属的其余成员的核酸相似性为52.7～57.4%,与Picornaviridae科中部分感染禽类的病毒的相似性均低于46.9%。遗传进化分析结果(见图1)显示,PiMeV-CHN001株与GenBank中其他2株野鸽源PiMeV(MeV-B1株和MeV-B2株)处于同一遗传进化分支(Megrivirus B型分支),均属于Megrivirus属分支。

图1 3C基因遗传进化分析Fig.1 Phylogenetic analysis based on the 3C gene of PiMeV

2.2 实时荧光定量RT-PCR条件

优化后的反应体系:SYBR Green I Master Mix 10 μL,上/下游引物各0.8 μL,模板2 μL,加去离子水至20 μL。最佳反应条件:95 ℃预变性2 min;95 ℃ 10 s,56 ℃ 15 s,72 ℃延伸15 s,40个循环。标准曲线结果所示:该方法的标准曲线在5.4×101～5.4×106拷贝·μL-1有良好的线性关系,相关系数(R2)为1.00,斜率-3.335,Y值37.93,扩增效率通过公式E=10-1/斜率-1换算结果为99.4%,说明该方法有较好的扩增效率。

2.3 敏感性、特异性和重复性分析

敏感性分析发现,建立的RT-qPCR方法最低检测限为54拷贝·μL-1(5.4×101拷贝·μL-1)。特异性分析(图2A)结果所示,扩增曲线图显示该方法仅能扩增出PiMeV,而与AIV、PPMV-1、PTTV、PiAd和PiCV无交叉反应,未见特征性荧光信号。熔解曲线(图2B)结果显示,仅有PiMeV出现特征性单一溶解曲线峰值,Tm值为(81.69±0.22)℃,表明建立的RT-qPCR方法特异性强。重复性试验表明,建立的RT-qPCR方法其批内变异系数(0.22%～0.45%)和批间变异系数(0.11%～0.80%)均小于1.00%。上述结果表明,建立的RT-qPCR方法敏感性高、特异性强、重复性好。

A. 扩增曲线;B. 熔解曲线;1. 鸽源微RNA病毒;2. 鸽源禽流感病毒;3. 鸽源禽I型副黏病毒;4. 鸽输血传播病毒;5. 鸽腺病毒;6. 鸽圆环病毒;7. ddH2O A. Amplification curve; B. Melting curves;1. PiMeV; 2. AIV; 3. PPMV-1; 4. PTTV; 5. PiAd, 6. PiCV; 7. ddH2O

2.4 临床样品的检测

用本研究建立的RT-qPCR进行检测,结果阳性样品2份,阳性率为4.7%。同时以常规RT-PCR检测,检测出阳性样品1份,阳性率为2.35%,常规RT-PCR检出的阳性样品在RT-qPCR的检测结果中同样为阳性,符合率为100%。将常规RT-PCR阳性经克隆测序分析可见,其3C基因和PiMeV-CHN001株核苷酸相似性为100%。

3 讨论

小核糖核酸病毒科的病毒感染宿主范围广泛,在多种哺乳动物和禽类中被发现,其中至少有13个属源自禽类[19];有2种重要的禽类疾病与Picornaviruses有关,分别是禽脑脊髓炎(avian Encephalomyelitis, AE)[20]和鸭病毒性肝炎(duck viral hepatitis,DVH)[21],目前发现的Megrivirus属病毒的成员均来源于家禽和野禽,除了可能与火鸡病毒性肝炎(Turkey viral hepaitis,TVH)[2]有关以外、还被认为与鸡吸收功能障碍综合征(malabsorption syndrome,MAS)[17]和鸡传染性腺胃炎(transmissible viral proventriculitis,TVP)相关[22],但目前均缺乏确切的证据,其主要原因是目前无法对该属的病毒进行体外有效分离培养。本研究前期尝试通过SPF鸡胚分离PiMeV病毒,同样无法分离到该病毒。

Picornaviruses科病毒的非结构蛋白基因1B、1C、1D、2C、3C和3D都是保守的[1]。本研究通过对已发布的PiMeV的序列进行比对,在3C基因片段处设计了一对PCR引物,并首次于轻度腹泻的信鸽粪便中扩增出目的片段,证实了在信鸽中存在PiMeV。3C基因表达的3C蛋白酶(3CPro)通过氢键网络将具有催化活性的氨基酸Cys、His、Asp或Glu连接形成活性催化基团(catalytic triad)的三联体,参与了小核糖核酸病毒的多聚蛋白加工,具有明显的病毒种属特异性。近年来,对于Picornaviruses科病毒3C蛋白的研究表明,该蛋白参与病毒前体蛋白的剪切,与促进病毒复制、调控细胞凋亡以及逃避免疫应答等[23]密切相关。本研究扩增了PiMeV中的3C基因并进行克隆测序,通过比对发现其与另外2株野鸽源PiMeV(MeV-B1株和MeV-B2株)处于同一遗传进化分支(Megrivirus B型分支),均属于Megrivirus属分支。其与MeV-B2株核苷酸相似性为92.0%,氨基酸相似性高达99.5%,仅为19处的His突变为Try,说明该基因的突变多为密码子的同义替换;3C蛋白具有半胱氨酸酶的特征催化基序Gly-X-Cys-Gly[24],通过氨基酸序列的比对与检索,在PiMeV中,该基序为GFCG,与同为Megrivirus属的其他种均不相同;MeV-B2与MeV-B1被认为是鸽源Megrivirus的两种类型[2],序列比对的结果说明MeV-CHN001与MeV-B1也有较高的相似性,核酸的相似性分别为89.5%,氨基酸序列的相似性为97.5%,显示3C基因有较高的保守性。同源比对结果显示,MeV-CHN001与来自于匈牙利的MeV-B2毒株的相似性较来自于中国香港的MeV-B1毒株高,没有表现出地理相关性,限于目前公布的PiMeV的基因较少,该结果还需要更多的毒株序列进行佐证。

实时荧光定量PCR具有快速、特异、灵敏的特点,适用于与临床检测,但尚未见相关检测技术应用PiMeV检测的报道。本研究以PiMeV的3C基因片段设计了一对特异性引物,通过条件优化建立了检测PiMeV的RT-qPCR方法,该方法有较强的特异性,仅对PiMeV检测出现阳性荧光信号,而与AIV、PPMV-1、PTTV、PiAd和PiCV等鸽源病毒无交叉反应;该方法有较高的灵敏度高,最低检测限为54拷贝·μL-1;重复性好,批内和批间的重复试验结果显示变异系数均较低。