羊伪结核棒状杆菌的分离鉴定及部分生物学特性分析

2024-03-01袁永丰钱虹宇李鑫灿罗洪艳王芝英周作勇

畜牧兽医学报 2024年2期

宋艳,袁永丰,钱虹宇,李鑫灿,罗洪艳,王芝英,周作勇

(西南大学动物医学院,重庆 402460)

伪结核棒状杆菌(Corynebacteriumpseudotuberculosis,Cp)为一种革兰阳性的兼性细胞内寄生菌,可感染多种动物和人并引起慢性炎症性疾病,如马溃疡性淋巴管炎、羊干酪样淋巴结炎(caseous lymphadenitis,CLA)、牛乳腺炎和人坏死性淋巴结炎等[1],其中以Cp感染羊引起的CLA最为常见。Cp感染山羊可造成多个方面的危害,包括降低生产性能、引起繁殖障碍、在羊体表及内脏器官形成脓肿而影响销售,以及Cp通过乳汁排出对食用羊奶的人群具有潜在危害等[2]。此外,因为Cp对外界环境的抵抗力强,且感染病程长,发病过程缓慢,一旦在羊场感染,则很难清除,是世界公认的难以防治的传染病之一[1-2]。羊CLA呈全世界分布,广泛流行,据世界动物卫生组织(OIE)统计,全球至少有64个国家确认有该病存在[3]。本病在意大利羊群中的血清阳性率为21.85%[4],巴西东北地区为30.3%[5],韩国为57.3%[6]。近年来,我国关于Cp感染山羊的报道日益增多,陕西[7]、四川[8]、重庆[9]、云南[10]、福建[11]等多个省市均有该病原感染的报道,其从脓肿样本中的分离率为39.22%～100.00%。本文通过对所采集的山羊体表淋巴结脓肿病料进行Cp分离及病原特性研究,以明确重庆和贵州发病羊场Cp感染情况,为该病原防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及小鼠

营养琼脂购自AOBOX公司;细菌微量生化鉴定管购自青岛海博生物技术有限公司;PremixTaq购自TaKaRa公司;核酸染料购自SBS赛百盛公司;药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司;脑心浸出液(BHI)肉汤、萘啶酸、磷霉素钠购自Solarbio公司。昆明系小鼠购自重庆莱彼特生物科技有限公司。

1.2 引物设计

参考伪结核棒状杆菌的cp40基因序列(OL347 712.1)设计检测引物:上游引物SF: 5′-ATGCATAATTCTCCTCHATCAGTC-3′,下游引物SR: 5′-TTATCTAGAACCAGTTGGCTTTCC-3′, 扩增片段为1 140 bp。其余基因,包括编码延伸因子(fusA)、磷脂酶D(pld)、铁摄取和调节相关毒力(因子FagA和FagB)、细菌σ因子(SigE)、小菌毛蛋白(SpaC)、锌依赖的超氧化物歧化酶(SodC)、蛋白激酶G(PknG)、神经氨酸酶(NanH)和寡肽透过酶(OppB、OppD、OppF)的检测引物均按文献设计[9],由上海百力格生物技术服务有限公司合成。

1.3 病料采集方法

对重庆市3个羊场(江津区、涪陵区和秀山县各1个),以及贵州省独山县1个羊场患脓肿的山羊采样,首先对脓肿部位皮肤用碘伏消毒,进而以无菌手术刀片切开皮肤,挤出脓汁或干酪样物质,收集于灭菌离心管中,低温送至实验室,进行病原分离培养。

1.4 细菌分离鉴定

将脓肿样本接种在含5%兔血琼脂平板上,37 ℃培养48 h。将疑似Cp的菌落接种在BHI液体培养基(磷霉素浓度为200 μg·mL-1,萘啶酸浓度为4 μg·mL-1)中震荡培养24 h,再次进行三区划线纯化。将分离菌接种生化试验管进行葡萄糖、木糖、甘露醇、麦芽糖、甲基红、氧化酶和硝酸盐还原的生化试验。勾取单菌落至肉汤中培养,以该菌液作为模板,以Cp的fusA基因特异性引物进行PCR扩增鉴定是否为Cp[9]。

1.5 细菌致病性试验

将15只昆明系小鼠随机分成5组,每组3只,体重为24～28 g。每个区县随机选择1株Cp(XS2、JJS-4、GZ-5和FL-2-5)在血平板划线培养,挑取单菌落至1 mL BHI肉汤中培养24 h,按每只小鼠腹腔注射0.2 mL菌液(含1.25×107CFU),对照组注射等量生理盐水,观察小鼠发病及死亡情况。

1.6 毒力基因PCR检测

以ATCC19410为对照,采用菌液PCR方法检测Cp毒力基因,针对每个毒力基因的PCR反应体系:PremixTaq12.5 μL,毒力基因上、下游引物各1.0 μL,培养Cp菌液2.0 μL,ddH2O 8.5 μL,总体积25.0 μL。反应条件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 40 s,60 ℃ 40 s,72 ℃ 40 s,共30个循环;72 ℃ 2 min。最后对PCR产物用1%的琼脂糖电泳检测。

1.7 药物敏感性试验及耐药基因检测

分别吸取培养至1.5×108CFU·mL-1的Cp菌液200 μL,均匀涂布于血琼脂平板上,将药敏纸片置于培养基的适当位置,37 ℃培养48 h,测量并记录抑菌圈大小,参考美国临床标准CLSI判定药敏结果。采用NCBI′s AMRFinderPlus进行Cp全基因组的耐药基因分析,发现在Cp菌中主要有2种耐药基因:氨基糖苷O-磷酸转移酶APH(3′)-IIa(aph(3′)-IIa)和广谱A类β内酰胺酶TEM-116(blaTEM-116)。设计aph(3′)-IIa和blaTEM-116特异性引物(aph3-F: 5′-GGAAGGGACTGGCTGCTA-3′和aph3-R: 5′-GCGCGCCTTGAGCCTGGC-3′,预计扩增片段270 bp;blaTEM116-F:5′-ATCGGAGG-ACCGAAGGAG-3′和blaTEM116-R:5′-TTTATCAGC-AATAAACCA-3′; 预计扩增片段279 bp),检测所分离菌株中耐药基因携带水平。

1.8 细菌fusA测序及序列分析

将fusA的PCR扩增产物送至擎科生物公司进行双向测序,拼接序列后提交至GenBank。分析所获得CpfusA序列的相似度,每个羊场选择一株菌fusA序列,同时在NCBI上选取国内外源自山羊、绵羊、马、水牛等宿主且已经有明确生物型信息的CpfusA序列,羊生物型(biotypeovis)包括CP001809、NC_017301、CP01079、NC_017301、NZ_CP012695、NZ_CP015100和NZ_MDWN01000001,马生物型(biotypeequi)包括CP003082、CP012022、NC_017307、NC_017730和NC_017945,以及溃疡棒状杆菌(C.ulcerans)、白喉棒状杆菌(C.diphtheriae)的fusA序列,用DNAstar Lasergene 7.1.0 进行相似度分析,以结核分支杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)的fusA序列为外群,用Clustal X 1.83程序进行序列对位排序,利用MEGA 4.0构建系统进化树。

2 结果

2.1 Cp分离鉴定

从重庆市江津区、涪陵区和秀山县,以及贵州省独山县发病山羊中共采集40份脓肿样本,获得23分离菌(重庆江津、涪陵、秀山和贵州独山县所各分离获得11、1、10和1株菌),分离率为57.5%。分离菌在血琼脂培养基上培养后出现1 mm大小,白色、不透明、干燥的菌落,接种环易将其在平板上推动,大部分菌株在血琼脂培养基出现β型溶血环。革兰染色镜检可见呈蓝紫色、球杆状细菌。选择部分菌株进行生化试验,结果显示葡萄糖、麦芽糖和甲基红试验结果为阳性,而木糖、甘露醇、氧化酶和硝酸盐还原试验结果为阴性,其结果符合《伯杰氏细菌鉴定手册》中Cp的生化特征。经Cp的fusA特异性引物PCR检测,所有分离菌均检测到fusA基因(图1)。综上,23株分离菌经鉴定为Cp。

M. 2000bp DNA相对分子质量标准;1. ATCC19410;2. FL-2-5; 3. GZ-5; 4～13. XS1、2、3、5、6、8、9、10、11、14;14～24. JJS-2、3、4、5、6、7、8、9、14、15、16;黑色箭头指fusA基因M. 2000 bp DNA marker;1. ATCC19410;2. FL-2-5; 3. GZ-5; 4-13. XS1, 2, 3, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 14;14-24. JJS-2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 16; The black arrow refers to the fusA gene

2.2 毒力基因PCR检测

对23株Cp菌株毒力基因PCR检测显示,所分离的Cp中均携带pld、FagA、FagB、SigE、SpaC、SodC、PknG、NanH、OppB、OppD、OppF和cp40基因。

2.3 对小鼠的致病性分析

致病性分析显示,不同地区的伪结核棒状杆菌分离株对小白鼠致病情况不一致,其攻毒后死亡时间为 40～138 h,其中秀山分离株(XS-2)致病力最强,在48 h内全部死亡,其次为江津分离株(JJS-4)和贵州分离株(GZ-5),所有小鼠均在64 h内死亡,最后为涪陵分离株(FL-2-5),攻毒小鼠在138 h内死亡。攻毒后小鼠表现为精神不振、被毛粗乱、扎堆、饮欲食欲减退和活动减少等。剖检发现,死亡时间在 48 h 内通常表现为脏器的出血肿胀,而死亡时间超过 48 h 的小鼠通常可见脏器多有脓肿(图2)。

A. Cp感染40 h死亡小鼠的肺有出血(黄色箭头);B. Cp感染138 h死亡小鼠肠壁上有脓肿(红色箭头)A. Lung bleeding of mice died 40 h after Cp infection (yellow arrow); B. Abscesses on the intestinal wall of mice died 138 h after Cp infection (red arrow)

2.4 药敏试验及耐药基因检测

药敏试验显示,不同地区分离的Cp其敏感性药物不完全一致。整体上,所分离Cp对头孢拉定、丁胺卡那和多西环素敏感率最高,达95.65%(22/23),其次为青霉素、氨苄西林、四环素、万古霉素和环丙沙星,敏感率为91.30%(21/23),但对呋喃唑酮100%耐药,对新霉素和卡那霉素耐药率为82.61%(19/23),对庆大霉素的耐药率为69.57%(表1)。耐药基因检测发现,所分离Cp菌株中aph(3′)-IIa和blaTEM-116携带率分别为0和4.35%(1/23)。对应药敏试验结果,发现检出blaTEM-116的Cp对β内酰胺类抗生素青霉素和氨苄西林具有耐药性。

表1 Cp的药敏试验结果

2.5 Cp测序及序列分析

将23株Cp的fusA基因PCR扩增产物进行测序并提交GenBank,获得登录号:ON969140～ON969162。相似度分析显示,除JJS-8 (ON969141)与其他Cp的相似度为99.9%,所获得Cp的fusA序列间相似度为100%。因此每个场选择1株Cp的fusA序列进一步分析,发现本次获得Cp与羊生物型Cp(biotypeovis)的fusA序列相似度为99.8%～99.9%,与马生物型Cp(biotypeequi)相似度为98.9%～99.2%,与溃疡棒状杆菌(C.ulcerans)相似度为94.0～94.3%,与白喉棒状杆菌(C.diphtheriae)相似度为91.5%～91.7%。多序列比对显示,羊生物型和马生物型Cp的fusA差异位点主要在924 bp(羊A/马C)、927 bp(羊C/马T)、972 bp(羊G/马A)、1 113 bp(羊C/马G)、1 149 bp(羊C/马T)、1230 bp(羊T/马G),而与其他羊生物型Cp相比,本次分离Cp的fusA基因序列差异点主要位于第1 389 bp处,所获得的序列该位点碱基为T,而其余Cp在该位点为C。氨基酸编码分析显示,仅在第371位氨基酸有差异,羊生物型为天冬氨酸(D),而马生物型为谷氨酸(E)。基于fusA的系统进化分析显示,除去外群,棒状杆菌共分为四个分支,分别为Cp羊生物型(biotypeovis)、Cp马生物型(biotypeequi)、溃疡棒状杆菌(C.ulcerans)和白喉棒状杆菌(C.diphtheriae),本研究所分离Cp聚类到Cp羊生物型(biotypeovis),提示所分离获得的Cp生物型为羊型(图3)。

枝上数字为Bootstrap 1 000次重复抽样百分比,三角形表示本研究获得的Cp fusA基因序列The numbers on the branches representing the bootstrap values of 1 000 samples, and the triangle representing the fusA gene sequences of Cp obtained in this study

3 讨论

Cp是引起绵羊、山羊等反刍动物脓肿病的主要病原之一,在众多诊断该病原感染的方法中,从脓肿样本中分离出伪结核棒状杆菌是最直接和最可靠的方法。本研究采用分离菌的菌落特征、染色特点并结合其延伸因子编码基因fusA的特异性引物进行PCR鉴定。发现所采集的山羊体表脓肿样本中Cp的分离率为57.5%(23/40),高于我国西南地区(39.22%,40/102)[9],以及墨西哥(35.63%,57/160)[12]、印度拉吉斯坦(51.9%,14/27)[13]报道的该病原分离率,而低于四川(65%,13/20)[8]、陕西(100%,9/9)[7]、埃及(90.07%,254/282)[14]报道的Cp分离率。致病力检测表明,所分离的Cp具有较强的致病力。以上结果表明,Cp仍然是重庆和贵州部分羊场引发山羊体表脓肿的重要病原,急需引起当地养殖户和相关部门的重视。

本研究发现91.30%以上的Cp对头孢拉定、青霉素和环丙沙星等多种抗生素敏感,但有82.61%的Cp对卡那霉素和新霉素耐药,69.57%的菌株对庆大霉素有耐药性。关于Cp药物敏结果的报道差异较大,如魏宇辰等[7]报道Cp对庆大霉素、环丙沙星敏感率达100%,但对青霉素耐药或中度敏感。徐志豪等[8]报道,Cp对庆大霉素和青霉素的耐药率分别达90.00%和95.00%,说明不同地区分离的Cp药物敏感性差异较大。本次分离的Cp对卡那霉素和庆大霉素的耐药率,远高于本实验室前期研究结果(10.53%的Cp对卡那霉素耐药,7.89%的Cp对庆大霉素耐药),提示即使在相近地区,不同养殖场中分离的Cp对抗生素的敏感性也有较大差异,这可能与不同羊场用药习惯有关。此外,本研究发现所有的Cp分离株对呋喃唑酮完全耐药,这与Li等[9]报道类似,深入发掘研究该病原对呋喃唑酮耐药的基因将有利于该病原的防治。关于Cp耐药基因相关研究极少,TEM是超广谱β内酰胺酶(ESBLs)主要的耐药基因型[15],其中TEM-116由Jeong等[16]首次在大肠杆菌和肺炎克雷伯菌临床分离株中检测到,本文在国内首次从Cp临床分离株中检测出blaTEM-116,且该菌对β内酰胺类抗生素青霉素和氨苄西林具有耐药性,提示该基因的存在可能与Cp菌株对β内酰胺类抗生素耐药有关。IIa型氨基糖苷类3′-O-磷酸转移酶(APH(3′)-IIa)是一种常见的细菌抗氨基糖苷类抗生素的酶[17],主要存在于革兰阳性菌中,虽然本研究发现Cp对氨基糖苷类的卡那霉素和庆大霉素耐药率较高,但并未检测出aph(3′)-IIa耐药基因,其原因是否与Cp中可能存在其他类别的氨基糖苷类耐药基因有待进一步研究。

毒力基因的PCR检测结果表明,所有分离菌株中均携带有pld、FagA、FagB、OppB、OppD、OppF、SodC、SpaC、pknG、NanH、sigE、cp40这些毒力或假定毒力基因,与Li等[9]的研究结果相似。而Guerrero等[12]报道在98.2%的菌株中检测到FagB基因,Aquino等[18]研究显示FagC的检出率为99.40%,FagD的检出率为95.23%,表明不同地区的Cp分离菌株毒力基因携带情况不完全一致。此外,本研究表明,即使是具有相似的毒力基因谱,其致病力也不完全相同,其原因是否与这些菌株携带了其他不同的毒力基因,或同种毒力基因的表达水平不同有关尚待进一步研究。

根据硝酸盐还原酶试验结果将Cp分为两个生物型,其中分离自马和牛的Cp通常为马生物型(biotypeequi,硝酸盐还原阳性),而分离自绵羊和山羊的Cp为羊生物型(biotypeovis,硝酸盐还原阴性)[19],本研究生化试验显示所检测菌株硝酸盐还原试验为阴性,说明分离菌为羊生物型。研究发现延长因子P(elongation factor P)编码基因(fusA)表达稳定,可作为定量分析Cp基因表达的内参[20]。此外,基于Cp管家基因fusA单独或联合其他管家基因dnaK、infB、groeL1和leuA的进化分析,有助于了解Cp的分子特征[9,21]。Li等[9]构建了基于fusA和16S rRNA的Cp系统进化树,发现利用fusA而不是16S rRNA,可以有效将Cp羊生物型和马生物型区分开,本文与Li等的研究结果一致,结合所分离的Cp硝酸盐还原试验阴性的结果,说明所分离的Cp均为羊生物型(biotypeovis)菌株。此外,本文进一步比对了羊生物型和马生物型fusA基因序列及编码氨基酸的差异,发现其碱基差异位点主要在第924、927、972、1 113、1 149和1 230 bp处,而氨基酸序列仅在第371位点有差异,提示虽然羊生物型和马生物型Cp的核苷酸差异位点较多,但对其编码蛋白功能可能影响不大,这些不同位点碱基改变与Cp出现羊生物型和马生物型分化的关系及具体机制还有待进一步研究。综上,本研究明确了引起重庆和贵州部分羊场发生体表淋巴结脓肿的Cp病原特点,为防控该病提供了参考资料。